Nouvelles

Les stratégies de diagnostic traditionnelles pour détecter les maladies infectieuses nécessitent l'utilisation d'instruments de paillasse qui ne conviennent pas aux tests au point de service (POCT).La microfluidique émergente est une technologie hautement miniaturisée, automatisée et intégrée qui constitue une alternative potentielle aux méthodes traditionnelles pour des diagnostics sur site rapides, peu coûteux et précis.Les méthodes de diagnostic moléculaire sont largement utilisées dans les dispositifs microfluidiques comme les méthodes les plus efficaces pour la détection d'agents pathogènes.Cette revue résume les avancées récentes dans le diagnostic moléculaire microfluidique des maladies infectieuses d'un point de vue académique et industriel.Tout d'abord, nous décrivons un traitement typique sur puce des acides nucléiques, y compris le prétraitement de l'échantillon, l'amplification et la lecture du signal.Les caractéristiques, avantages et inconvénients des quatre types de plateformes microfluidiques sont ensuite comparés.Ensuite, nous discuterons de l'utilisation des tests numériques pour la quantification absolue des acides nucléiques.Les dispositifs de diagnostic moléculaire à base de microfluidique commerciaux classiques et récents sont résumés comme preuve de l'état actuel du marché.Enfin, nous proposons des orientations futures pour le diagnostic microfluidique des maladies infectieuses.
Les maladies infectieuses sont causées par des agents pathogènes, notamment des bactéries, des virus et des parasites, qui sont répartis dans le monde entier.Contrairement à d'autres maladies, les agents pathogènes s'infectent rapidement et se propagent entre les humains et les animaux hôtes par inoculation, air et eau [1].La prévention des maladies infectieuses est essentielle en tant que mesure de santé publique.Trois stratégies principales pour lutter contre les maladies infectieuses : (1) contrôler la source d'infection ;(2) interruption du chemin de transmission;(3) protection des populations sensibles.Parmi les principales stratégies, le contrôle de la source d'infection est considéré comme la stratégie la plus importante en raison de sa commodité et de son faible coût.Le diagnostic rapide, l'isolement et le traitement des personnes infectées sont essentiels, nécessitant des stratégies de diagnostic rapides, sensibles et précises [2].Le diagnostic actuel des maladies infectieuses combine généralement un examen clinique basé sur les signes et les symptômes et des études de laboratoire telles que la culture cellulaire et le diagnostic moléculaire, qui nécessitent un personnel qualifié, des procédures à forte intensité de main-d'œuvre et un équipement de test coûteux [3, 4].La prévention des épidémies de maladies infectieuses nécessite un diagnostic local rapide, peu coûteux et précis, en particulier dans les zones à ressources limitées où les maladies infectieuses sont courantes et graves [5], ainsi qu'un traitement dans la nature ou sur le champ de bataille, où les urgences sont imprévisibles..les soins médicaux sont limités [6].Dans ce contexte, la microfluidique est une technologie qui combine les technologies des systèmes microélectromécaniques, la nanotechnologie ou la science des matériaux pour une manipulation précise des fluides [7,8,9,10], offrant de nouvelles possibilités pour la détection au point de service (POCT).) agents infectieux en dehors des hôpitaux et des laboratoires.Par rapport aux diagnostics traditionnels qui prennent du temps, la technologie microfluidique offre des économies d'échantillons et de coûts pour les diagnostics moléculaires lors d'épidémies.La propagation mondiale de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) est causée par le syndrome respiratoire aigu sévère coronavirus 2 (SRAS-CoV-2), de sorte que l'importance de la microfluidique pour la prévention et le contrôle en temps opportun de la pandémie est à nouveau soulignée [11, 12 , 13].Contrairement aux diagnostics traditionnels, la POCT microfluidique utilise de petits appareils portables allant des analyseurs de paillasse aux petites bandelettes de test latérales pour tester près du point d'échantillonnage [14].Ces tests présentent une préparation d'échantillon simpliste ou inexistante, une amplification rapide du signal et des lectures de signal sensibles, ce qui se traduit par une courte durée et des résultats précis en quelques minutes.La disponibilité et la production de masse d'instruments de santé basés sur la microfluidique ont élargi leurs applications de diagnostic rentables et directes en dehors de l'hôpital, à proximité du patient et même à domicile.
Parmi les stratégies existantes de diagnostic des maladies infectieuses, le diagnostic moléculaire est l'une des plus sensibles [15, 16].De plus, le diagnostic moléculaire est souvent utilisé comme référence pour la détection continue du COVID-19, permettant la détection directe des régions spécifiques du virus de l'ARN ou de l'ADN avant le début d'une réponse immunitaire [17, 18].Dans la présente revue, nous présentons les dernières avancées dans les processus de diagnostic moléculaire basés sur la microfluidique pour les maladies infectieuses, d'un point de vue académique aux perspectives industrielles futures (Fig. 1).Nous commencerons par trois étapes clés dans la détection des acides nucléiques : le prétraitement des échantillons sur puce, l'amplification des acides nucléiques et la lecture du signal.Nous avons ensuite comparé différents types de plateformes microfluidiques avec leur structure et leur fonction, montrant des caractéristiques uniques (forces et faiblesses).La détection numérique des acides nucléiques est discutée plus en détail et donnée comme exemple d'une technologie de troisième génération pour la quantification absolue des molécules pathogènes infectieuses.En outre, plusieurs dispositifs POCT commerciaux typiques et les plus récents seront présentés pour démontrer l'état actuel du marché POCT microfluidique pour le diagnostic moléculaire.Nous discuterons et expliquerons également notre vision des applications futures.
Les modules de puces microfluidiques pour la détection des acides nucléiques peuvent être divisés en trois catégories (échantillonnage, reconnaissance et signalisation) selon leurs fonctions [19].Parmi ces modules, le module de prélèvement réalise principalement la lyse des échantillons et l'extraction des acides nucléiques.Le module capteur contrôle principalement la conversion et l'amplification des signaux d'acide nucléique.Le module de signalisation détecte le signal converti et traité par le module de détection.En nous basant sur le procédé de détection d'acides nucléiques sur une puce, nous allons résumer les différentes puces pouvant réaliser la fonction « entrée et sortie ».
La première étape de la détection d'acide nucléique est l'extraction de l'acide nucléique, c'est-à-dire l'isolement de l'acide nucléique cible de l'échantillon d'origine.L'extraction d'acide nucléique est effectuée pour purifier les acides nucléiques d'autres contaminants moléculaires, assurer l'intégrité de la structure primaire des molécules d'acide nucléique et optimiser les résultats.L'extraction d'acide nucléique nécessite la lyse d'échantillon et la capture d'acide nucléique nécessaires, dont la qualité et l'efficacité ont un impact énorme sur les résultats de recherche et de diagnostic.Tout effet secondaire subtil lors de l'extraction peut limiter la détection ultérieure.Par exemple, les méthodes de réaction en chaîne par polymérase (PCR) et d'amplification isotherme en boucle (LAMP) sont inhibées par certains solvants organiques résiduels tels que l'éthanol et l'isopropanol dans les réactifs d'isolement des acides nucléiques [20].L'extraction liquide-liquide et l'extraction en phase solide sont les méthodes les plus populaires pour isoler les acides nucléiques [21], cependant, l'extraction liquide-liquide sur une puce est extrêmement limitée, car les réactifs utilisés dans l'extraction liquide-liquide provoquent la corrosion de la plupart des puces microfluidiques. .Ici, nous mettons en évidence les méthodes d'extraction en phase solide à base de puces à ADN et comparons leurs avantages et leurs inconvénients.
Le silicium est un matériau de substrat compatible avec les acides nucléiques en raison de sa biocompatibilité, de sa stabilité et de sa facilité de modification [22].Fait important, lorsqu'il est modifié avec de la silice ou d'autres matériaux, ce composite présente des propriétés pour adsorber les acides nucléiques chargés négativement dans des conditions de faible pH et de sel élevé tout en éluant avec des solutions à pH élevé et faible en sel.Sur la base de ce phénomène, il est possible de purifier l'acide nucléique.
Diverses formes de matériaux à base de silice ont été utilisées pour l'extraction d'acide nucléique en microfluidique, telles que des billes de silice, des poudres, des filtres en microfibre et des membranes de silice [23, 24, 25, 26].Selon les propriétés du matériau, les matériaux à base de silicium peuvent être utilisés dans les microcircuits de différentes manières.Par exemple, les granules de silice, les poudres et les nanofiltres commerciaux peuvent simplement être placés dans les pores ou les microcanaux des puces microfluidiques et aider à extraire les acides nucléiques des échantillons [27, 28, 29].Les membranes de silice modifiées en surface peuvent également être utilisées pour purifier rapidement l'ADN des agents pathogènes à faible coût.Par exemple, Wang et al.[30] En combinant des réactions d'amplification dénaturantes avec un échange de chaîne à médiation vésiculaire avec des membranes de silice recouvertes d'oligosaccharides de chitosane, un système portable polyvalent a été introduit qui a détecté avec succès 102 à 108 unités formant des colonies.(UFC)/ml Vibrio parahaemolyticus., et la présence du virus était facilement visible.Powel et al.[31] Des puces à ADN à base de silicium ont ensuite été utilisées pour détecter le virus de l'hépatite C (VHC), le virus de l'immunodéficience humaine (VIH), le virus Zika et le papillomavirus humain et la propagation automatique, dans laquelle un microréacteur tortueux de 1,3 μl a été développé pour capturer les virus à ARN.et effectuer une amplification in situ.En plus de ces méthodes, les microcolonnes de silice modifiées en surface jouent également un rôle clé dans l'extraction des acides nucléiques, car la géométrie et les propriétés du matériau de modification augmentent considérablement l'efficacité de l'extraction.Chen et al.[32] ont proposé une plate-forme microfluidique pour l'isolement d'ARN à faible concentration basée sur des microcolonnes de silicium recouvertes d'amino.Ce dispositif microfluidique intègre un réseau de micropiliers de 0,25 cm2 sur un substrat de silicium pour obtenir une efficacité d'extraction plus élevée grâce à une conception à rapport surface/volume élevé.L'avantage de cette conception est que le dispositif microfluidique peut atteindre jusqu'à 95 % d'efficacité d'extraction d'acide nucléique.Ces stratégies à base de silicium démontrent l'intérêt d'isoler rapidement des acides nucléiques à faible coût.En combinaison avec des puces microfluidiques, les stratégies d'extraction à base de silicium peuvent non seulement augmenter l'efficacité de la détection des acides nucléiques, mais également faciliter la miniaturisation et l'intégration des dispositifs analytiques [20].
Les méthodes de séparation magnétique utilisent des particules magnétiques pour isoler les acides nucléiques en présence d'un champ magnétique externe.Les particules magnétiques couramment utilisées comprennent les particules magnétiques Fe3O4 ou γ-Fe2O3 recouvertes de silice, d'amino et de carboxyle [33,34,35,36].La caractéristique distinctive des particules magnétiques par rapport aux méthodes SPE à base de silicium est la facilité de manipulation et de contrôle avec des aimants externes.
En utilisant l'interaction électrostatique entre les acides nucléiques et la silice, dans des conditions de sel élevé et de pH bas, les acides nucléiques sont adsorbés à la surface des particules magnétiques recouvertes de silice, tandis que dans des conditions de sel bas et de pH élevé, les molécules peuvent être lavées encore..Les billes magnétiques recouvertes de silice permettent d'extraire l'ADN d'échantillons de grand volume (400 μL) en utilisant un mouvement contrôlé magnétiquement [37].A titre de démonstration, Rodriguez-Mateos et al.[38] ont utilisé des aimants accordables pour contrôler le transfert de billes magnétiques dans différentes chambres.Sur la base de particules magnétiques revêtues de silice, 470 copies/mL d'ARN génomique du SRAS-CoV-2 peuvent être extraites d'échantillons d'eaux usées pour la détection de transcription inverse LAMP (RT-LAMP) et la réponse peut être lue en 1 heure.à l'œil nu (Fig. 2a).
Dispositifs à base de matériaux magnétiques et poreux.Schéma conceptuel du dispositif microfluidique IFAST RT-LAMP pour la détection de l'ARN du SARS-CoV-2 (adapté de [38]).b Microdispositif centrifuge pour dSPE d'acide nucléique d'écouvillon buccal (adapté de [39]).c Concentrateur d'échantillons auto-alimenté intégré utilisant une carte FTA® (adapté de [50]).d Papier filtre Fusion 5 modifié avec du chitosane (adapté de [51]).SRAS-CoV-2 coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère 2, amplification isotherme médiée par la boucle de transcription inverse RT-LAMP, partenaires technologiques des détecteurs FTA, acide nucléique NA
Les particules magnétiques chargées positivement sont idéales pour fixer le squelette phosphate d'un acide nucléique.A une certaine concentration en sel, les groupes phosphate chargés négativement des acides nucléiques peuvent être chargés positivement à la surface des particules composites magnétiques.Par conséquent, des nanoparticules magnétiques avec une surface rugueuse et une haute densité de groupes amino ont été développées pour l'extraction d'acides nucléiques.Après séparation magnétique et blocage, les nanoparticules magnétiques et les complexes d'ADN peuvent être directement utilisés en PCR, ce qui élimine le besoin d'opérations de purification et d'élution complexes et chronophages [35].Des nanoparticules magnétiques recouvertes de groupes carboxyle négatifs ont également été utilisées pour séparer les acides nucléiques adsorbés sur des surfaces dans des solutions à haute concentration de polyéthylène glycol et de chlorure de sodium [36].Avec ces billes magnétiques modifiées en surface, l'extraction d'ADN est compatible avec une amplification ultérieure.Dignan et al.[39] ont décrit une plateforme microfluidique centrifuge automatisée et portable pour le prétraitement des acides nucléiques, permettant au personnel non technique de l'utiliser sur site.De plus, la compatibilité de l'ADN isolé avec LAMP, une méthode bien adaptée à l'analyse des acides nucléiques au point de service, démontre en outre les exigences minimales en matière d'équipement et l'adéquation aux dosages colorimétriques (Fig. 2b).
Les méthodes de billes magnétiques offrent la possibilité d'une extraction automatisée, dont certaines existent dans les extracteurs d'acides nucléiques automatisés commerciaux [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, États-Unis), QIAcube® HT ;CapitalBio (Pékin, Chine) et Biomek® ;Beckman (Miami, États-Unis).), Floride, États-Unis)].Les avantages de la combinaison de billes magnétiques avec la microfluidique peuvent être utilisés pour une extraction automatisée efficace des acides nucléiques, ce qui pourrait potentiellement faire progresser le développement du diagnostic moléculaire ;cependant, la combinaison de billes magnétiques avec la microfluidique repose encore fortement sur des systèmes de contrôle complexes pour une manipulation précise des billes magnétiques, ce qui explique la popularité des produits commerciaux encombrants et coûteux, ce qui limite l'application ultérieure des billes magnétiques dans POCT.
Plusieurs matériaux poreux tels que des filtres de nitrocellulose modifiés, des cartes Finders Technology Associates (FTA), des papiers filtres à base de polyéthersulfone et des matériaux recouverts de glycane ont également été utilisés pour la détection des acides nucléiques [40, 41, 42, 43, 44].Les matériaux fibreux poreux tels que le papier fibreux ont d'abord été utilisés pour isoler l'ADN en enchevêtrant physiquement des molécules d'ADN à long brin avec des fibres.Les petits pores entraînent une forte restriction physique des molécules d'ADN, ce qui affecte positivement l'extraction de l'ADN.En raison des différentes tailles de pores du papier fibreux, l'efficacité de l'extraction ne peut pas répondre aux besoins d'amplification de l'ADN [45, 46].La carte FTA est un papier filtre commercial utilisé dans le domaine de la médecine légale et largement utilisé dans d'autres domaines du diagnostic moléculaire.Grâce à l'utilisation de papier filtre en cellulose imprégné de divers produits chimiques pour lyser les membranes cellulaires de l'échantillon, l'ADN libéré est protégé de la dégradation jusqu'à 2 ans.Plus récemment, du papier de cellulose imprégné a été développé pour la détection moléculaire de divers agents pathogènes, notamment le SRAS-CoV-2, la leishmaniose et le paludisme [47,48,49].Le VIH dans le plasma isolé est directement lysé et l'acide nucléique viral est enrichi dans la membrane de flux FTA® intégrée au concentrateur, ce qui permet une production efficace de l'acide nucléique [50] (Fig. 2c).Le principal problème avec la détection d'acide nucléique à l'aide de cartes FTA est que des produits chimiques tels que la guanidine et l'isopropanol inhibent les réactions d'amplification ultérieures.Pour résoudre ce problème, nous avons développé le papier filtre Fusion 5 modifié au chitosan, qui combine les avantages de l'entrelacement physique des molécules d'ADN et du papier filtre fibreux, et de l'adsorption électrostatique de l'ADN sur les composés modifiés au chitosan pour obtenir une extraction d'acide nucléique très efficace. ..fibres filtrantes [51] (Fig. 2d).De même, Zhu et al.[52] ont démontré une méthode de PCR modifiée au chitosane basée sur un système microfluidique capillaire in situ pour l'isolement et la détection rapides de l'ARN du virus Zika.Les acides nucléiques peuvent être adsorbés/désorbés dans un milieu mixte lysat/PCR, respectivement, sur la base de la propriété d'interrupteur marche/arrêt du chitosane.marche et arrêt », sensible au pH.
Comme mentionné ci-dessus, ces stratégies combinent les avantages de divers matériaux en phase solide et augmentent l'efficacité de l'extraction des acides nucléiques en microfluidique.Dans des applications pratiques, l'utilisation de ces matériaux en grandes quantités n'est pas économique, et un traitement de surface approprié ou une modification de surface de matériaux courants avec ces matériaux peut également préserver leur fonction.Par conséquent, on pense que la mise en œuvre de ces stratégies après une étude pilote peut réduire les coûts.
Les tests d'acides nucléiques sur des plateformes microfluidiques utilisent souvent de petits volumes d'échantillons (< 100 µl), nécessitent donc une amplification des acides nucléiques cibles avec des sondes spécifiques pour la conversion en un signal pratique pour la détection en aval (optique, électrique et magnétique) [53, 54]. Les tests d'acides nucléiques sur des plateformes microfluidiques utilisent souvent de petits volumes d'échantillons (< 100 µl), nécessitent donc une amplification des acides nucléiques cibles avec des sondes spécifiques pour la conversion en un signal pratique pour la détection en aval (optique, électrique et magnétique) [53, 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. Lors du test d'acides nucléiques sur des plates-formes microfluidiques, de petits volumes d'échantillons (<100 µL) sont souvent utilisés, de sorte que l'amplification des acides nucléiques cibles avec des sondes spéciales est nécessaire pour le convertir en un signal pratique pour une détection ultérieure (optique, électrique et magnétique) [53, 54].微流控 平台 上 的 核酸 检测 通常 使用 小样本量 （<100 µl） ， 因此 需要 使用 特定 探针 扩增 目标 核酸 ， 以 转换 为 便于 下游 检测 （光学 、 电学 和） 的 的 信号 [53, 54 ]。微流控 平台 上 的 核酸 检测 使用 小样本量 （（<100 µl） ， 因此 需要 特定 探针 扩增 目标 ， 以 转换 为 下游 下游 （光学 、 电学 磁学） 的 信号 信号 转换 转换 转换 为 为 下游 下游 （光学 、 电学 磁学） 信号 [53, 54, 54, 54 ]。 Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. La détection d'acides nucléiques sur des plateformes microfluidiques utilise généralement de petits volumes d'échantillons (<100 μl), ce qui nécessite une amplification des acides nucléiques cibles avec des sondes spéciales pour les convertir en signaux pour une détection ultérieure (optique, électrique et magnétique) [53, 54]] .L'amplification des acides nucléiques en microfluidique peut également accélérer les réactions, optimiser les limites de détection, réduire les besoins en échantillons et améliorer la précision de la détection [55, 56].Ces dernières années, avec la réalisation d'une détection rapide et précise, diverses méthodes d'amplification d'acide nucléique ont été appliquées en microfluidique, notamment la PCR et certaines réactions d'amplification isotherme.Cette section résumera les méthodes de détection d'acide nucléique basées sur des systèmes microfluidiques.
La PCR est une simulation du processus de réplication de l'ADN d'un organisme, dont la théorie est décrite en détail ailleurs et ne sera pas discutée ici.La PCR peut amplifier une très petite quantité d'ADN/ARN cible à un taux exponentiel, faisant de la PCR un outil puissant pour la détection rapide des acides nucléiques.Au cours des dernières décennies, de nombreux dispositifs microfluidiques portables équipés de systèmes de cyclage thermique PCR ont été développés pour répondre aux besoins de diagnostic au point de service [57, 58].La PCR sur puce peut être divisée en quatre types (conventionnelle, à flux continu, à commutation spatiale et PCR convective) selon différentes méthodes de contrôle de la température [59].Par exemple, Gee et al.[60] ont développé une méthode de PCR quantitative de transcription inverse directe (RT-qPCR) sur leur propre plateforme microfluidique pour la détection multiplex des virus SARS-CoV-2, influenza A et B dans des prélèvements de gorge (Fig. 3a) .Parc et al.[61] ont construit une simple puce d'analyse des agents pathogènes en intégrant une PCR à couche mince, des électrodes et un module microfluidique à base de polydiméthylsiloxane actionné au doigt.Cependant, les deux travaux incarnent les lacunes communes de la PCR conventionnelle.La PCR nécessite un cycle thermique, ce qui limite la miniaturisation supplémentaire de l'appareil et réduit le temps de test.
Le développement d'une PCR microfluidique et spatiale à flux continu est essentiel pour résoudre ce problème.En utilisant un long canal serpentin ou un court canal droit, la PCR à flux continu peut fournir une amplification rapide en faisant circuler activement des réactifs dans trois zones de préchauffage avec une pompe hors puce.Cette opération évite avec succès la phase de transition entre les différentes températures de réaction et réduit ainsi considérablement le temps de test [62] (Fig. 3b).Dans une autre étude de Jung et al.[63] ont proposé un nouvel analyseur génétique PCR rotatif qui combine les caractéristiques de la PCR fixe et en flux pour la PCR transcription inverse ultrarapide et multiplex (Fig. 3c).Pour l'amplification d'acide nucléique, la micropuce PCR sera tournée à travers trois blocs chauffants à différentes températures : 1. Bloc de dénaturation à 94 °C, 2. Bloc d'hybridation à 58 °C, 3. Bloc d'expansion à 72 °C.
Application de la PCR en microfluidique.Représentation schématique de la dirRT-qPCR sur une plateforme microfluidique (adapté de [60]).b Représentation schématique d'un microréseau de PCR à flux continu basé sur un canal serpentin (adapté de [62]).c Représentation schématique d'un analyseur génétique PCR rotatif, composé d'une micropuce, de trois blocs chauffants et d'un moteur pas à pas (adapté de [63]).d Schéma de thermoconvection PCR avec centrifugation et montage (adapté de [64]).DirRT-qPCR, réaction en chaîne par polymérase de transcription inverse quantitative directe
En utilisant des capillaires et des boucles ou même des plaques minces, la PCR par convection peut rapidement amplifier les acides nucléiques par convection thermique libre naturelle sans avoir besoin d'une pompe externe.Par exemple, une plate-forme microfluidique de polymère d'oléfine cyclique a été développée sur une étape de chauffage rotative fabriquée qui utilise le cyclage thermique avec centrifugation dans un microcanal à boucle PCR [64] (Fig. 3d).La solution réactionnelle est entraînée par convection thermique, qui échange en continu haute et basse température dans un microcanal à structure annulaire.L'ensemble du processus d'amplification peut être complété en 10 minutes avec une limite de détection de 70,5 pg/canal.
Comme prévu, la PCR rapide est un outil puissant pour les systèmes de diagnostic moléculaire et d'analyse multiplex entièrement intégrés.La PCR rapide réduit considérablement le temps nécessaire pour détecter le SRAS-CoV-2, ce qui contribue au contrôle efficace de la pandémie de COVID-19.
La PCR nécessite un thermocycleur complexe qui ne convient pas au POCT.Plus récemment, des techniques d'amplification isotherme ont été appliquées à la microfluidique, y compris, mais sans s'y limiter, la LAMP, l'amplification par recombinase polymérase (RPA) et l'amplification basée sur des séquences d'acides nucléiques [65, 66, 67, 68].Avec ces techniques, les acides nucléiques sont amplifiés à une température constante, ce qui facilite la création de dispositifs POCT portables à faible coût et très sensibles pour les diagnostics moléculaires.
Les tests LAMP basés sur la microfluidique à haut débit permettent la détection multiple de maladies infectieuses [42, 69, 70, 71].En combinaison avec un système microfluidique centrifuge, LAMP peut encore faciliter l'automatisation de la détection des acides nucléiques [69, 72, 73, 74, 75].Le SlipChip spin-and-react a été développé pour la détection visuelle de plusieurs bactéries parallèles à l'aide de LAMP [76] (Fig. 4a).Lors de l'utilisation de LAMP optimisé dans le test, le rapport signal/bruit de fluorescence était d'environ 5 fois et la limite de détection atteignait 7,2 copies/μl d'ADN génomique. De plus, l'existence de cinq pathogènes bactériens digestifs communs, y compris Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis et Vibrio parahaemolyticus, a été visualisée sur la base de la méthode en < 60 min. De plus, l'existence de cinq pathogènes bactériens digestifs communs, y compris Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis et Vibrio parahaemolyticus, a été visualisée sur la base de la méthode en < 60 min.De plus, la présence de cinq pathogènes bactériens courants du tube digestif, dont Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis et Vibrio parahaemolyticus, a été visualisée à l'aide de cette méthode en moins de 60 minutes.此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 可 视化 了 五 种 常见 消化道 细菌病 原体 的 存在 ， 包括 芽孢杆菌 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 肠 沙门 沙门 氏 、 河流 弧菌 和 副溶血性 弧菌。 肠杆菌 肠 沙门 氏 菌 河流 弧菌 和 副溶血性 弧菌。此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 视化 了 五 种 常见 消化道 细菌病 的 存在 ， 包括 芽孢杆菌 、 肠杆菌 肠杆菌 、 肠 氏 、 、 弧菌 和 性 。。。 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌HIP 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌En outre, la présence de cinq agents pathogènes gastro-intestinaux bactériens courants, notamment Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius et Vibrio parahaemolyticus, a été visualisée à l'aide de cette méthode en moins de 60 minutes.
Les avantages de LAMP en microfluidique comprennent, entre autres, une réponse rapide et une détection miniaturisée.Cependant, en raison de la température de réaction (environ 70°C), des aérosols sont inévitablement générés pendant le LAMP, ce qui entraîne un taux élevé de faux positifs.La spécificité du test, la conception des amorces et le contrôle de la température doivent également être optimisés pour LAMP.De plus, les conceptions de puces qui implémentent la détection de cibles multiples sur une seule puce sont d'une grande valeur et devraient être développées.De plus, LAMP convient à la détection polyvalente intégrée dans une seule puce, ce qui est d'une grande importance, mais il y a encore beaucoup de place pour le développement.
Le taux élevé de faux positifs de LAMP peut être partiellement réduit avec la RPA, car la température de réaction relativement basse (~ 37 ° C) entraîne relativement peu de problèmes d'évaporation [77].Dans le système RPA, deux amorces opposées initient la synthèse d'ADN en se liant à une recombinase et l'amplification peut être achevée en 10 minutes [78,79,80,81].Par conséquent, l'ensemble du processus RPA est beaucoup plus rapide que la PCR ou la LAMP.Ces dernières années, il a été démontré que la technologie microfluidique améliore encore la vitesse et la précision de la RPA [82,83,84].Par exemple, Liu et al.[85] ont développé un test d'amplification de recombinase par polymérase à flux latéral intégré microfluidique pour une détection rapide et sensible du SRAS-CoV-2 en intégrant la transcription inverse RPA (RT-RPA) et un système universel de détection de bandelettes de test à flux latéral.dans un seul système microfluidique.Figure 4b).La limite de détection est de 1 copie/µl ou 30 copies/échantillon, et la détection peut être achevée en 30 minutes environ.Kong et al.ont développé un dispositif microfluidique portable.[86] ont utilisé la température corporelle et un système de détection de fluorescence basé sur un téléphone portable pour détecter rapidement et directement l'ADN du VIH-1 à l'aide de RPA (Figure 4c).Le test RPA portable détecte 100 copies/mL de la séquence cible en 24 minutes, démontrant un grand potentiel pour le diagnostic rapide des nourrissons infectés par le VIH-1 dans les milieux à ressources limitées.
Amplification isotherme dans les tests au point de service (POCT).Développement et production de spin et réaction SlipChip.Après soudage plasma, les puces supérieure et inférieure ont été assemblées avec un jeu d'écrous pour former la puce finale (adapté de [76]).b Schéma du système MI-IF-RPA pour la détection du COVID-19 (adapté de [85]).c Schéma d'un test RPA portable pour la détection rapide de l'ADN du VIH-1 (adapté de [86]).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM carboxyfluorescéine, virus de l'immunodéficience humaine VIH, RPA recombinase polymérase amplification, LED diode électroluminescente, MI-IF-RPA Recombinase-polymérase à flux latéral intégré Microfluidique Amplification
La RPA basée sur la microfluidique se développe rapidement, cependant, le coût de fabrication des puces et la consommation de réaction sont trop élevés et doivent être réduits pour augmenter la disponibilité de cette technologie.De plus, la haute sensibilité de la RPA peut affecter l'amplification de produits non spécifiques, notamment en présence de contamination.Ces limitations peuvent affecter l'application de la RPA dans les systèmes microfluidiques et méritent une optimisation supplémentaire.Des amorces et des sondes bien conçues pour diverses cibles sont également nécessaires pour améliorer la faisabilité des stratégies microfluidiques basées sur RPA dans POCT.
Cas13 et Cas12a ont la capacité de cliver aléatoirement des acides nucléiques et peuvent donc être développés comme outils de détection et de diagnostic.Cas13 et Cas12a sont activés lors de la liaison à l'ADN ou à l'ARN cible, respectivement.Une fois activée, la protéine commence à cliver d'autres acides nucléiques à proximité, après quoi des ARN guides ciblant des acides nucléiques spécifiques à un agent pathogène peuvent cliver des sondes fluorescentes éteintes et libérer de la fluorescence.Sur la base de cette théorie, Kellner et al.[87] ont développé une méthode basée sur Cas13 [Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKING (SHERLOCK)], et Broughton et al.[88] ont développé une autre approche basée sur Cas12a [CRISPR Trans Reporter ciblant l'ADN endonucléase (DTECR)].
Ces dernières années, diverses méthodes de détection d'acides nucléiques basées sur CRISPR sont apparues [89, 90].Les méthodes conventionnelles basées sur CRISPR prennent souvent du temps et demandent beaucoup de main-d'œuvre en raison de plusieurs procédures, notamment l'extraction d'acide nucléique, l'amplification et la détection CRISPR.L'exposition de liquides à l'air peut augmenter le risque de résultats faussement positifs.Compte tenu de ce qui précède, les systèmes basés sur CRISPR ont un besoin urgent d'optimisation.
Une plateforme microfluidique à commande pneumatique pouvant effectuer 24 analyses en parallèle a été développée pour les applications de détection CRISPR-Cas12a et CRISPR-Cas13a [91].Le système est équipé d'un dispositif de détection de fluorescence qui contourne l'amplification des acides nucléiques et détecte automatiquement les échantillons d'ADN et d'ARN femtomolaires.Chen et al.[92] amplification intégrée de la recombinase avec le système CRISPR-Cas12a en microfluidique centrifuge (Fig. 5a).Ce travail surmonte la difficulté d'intégrer ces deux processus car Cas12a peut digérer l'ADN messager et inhiber le processus d'amplification.De plus, Chen et al.[92] ont en outre pré-stocké les réactifs de réaction dans un contrôle microfluidique centrifuge pour compléter automatiquement l'ensemble du processus.Dans un autre travail, Silva et al.[93] ont développé une méthode de diagnostic sans amplification CRISPR/Cas12a et un smartphone pour détecter le SARS-CoV-2 (Fig. 5b).Ce test, connu sous le nom de système sans amplification basé sur un téléphone portable, comprend une enzyme dépendante de CRISPR/Cas qui est basée sur la visualisation par smartphone des signaux de bulles générés par la catalase dans les canaux microfluidiques.Détection sensible de moins de 50 copies/µl d'acide nucléique sans pré-amplification, l'ensemble du processus, de l'injection de l'échantillon à la lecture du signal, ne prend que 71 minutes.
Méthodes de détection des acides nucléiques basées sur CRISPR.POCT centrifuge pour le diagnostic moléculaire intégré basé sur CRISPR (adapté de [92]).b Développement du test CASCADE pour l'analyse du SRAS-CoV-2 sur smartphone (adapté de [93]).Amplification de la recombinase RAA, motif protospacer adjacent PAM, répétitions palindromiques courtes groupées CRISPR à intervalles réguliers, système CASCADE sans amplification de téléphone portable avec des enzymes dépendantes de CRISPR/CAS, chlorhydrate de 1-éthyl-3-[3-diméthylaminopropyl]carbodiimide EDC
En tant que dernière étape de la détection des acides nucléiques, la détection du signal reflète directement les résultats du diagnostic et constitue un facteur critique dans le développement d'un POCT efficace, sensible et précis.Les signaux peuvent être lus à l'aide de diverses méthodes telles que les stratégies fluorescentes, électrochimiques, colorimétriques et magnétiques.Dans cette section, nous décrivons la justification de chaque approche et comparons le diagnostic moléculaire des maladies infectieuses en microfluidique.
Les stratégies basées sur la fluorescence sont largement utilisées pour le diagnostic POCT des maladies infectieuses en raison de leurs avantages remarquables d'excellente sensibilité, de faible coût, de facilité d'utilisation et d'analyse au point de service [94, 95].Ces stratégies utilisent des fluorophores marqués tels que des colorants fluorescents et des nanomatériaux pour créer un signal détectable (amélioration de la fluorescence ou extinction).Cette découverte suggère que les stratégies basées sur la fluorescence peuvent être divisées en marquage fluorescent direct, détection fluorescente signal-on et signal-off [96].La détection directe de marqueurs fluorescents utilise des marqueurs fluorescents spéciaux pour marquer des ligands spécifiques qui génèrent une quantité spécifique de fluorescence lorsqu'ils sont liés sélectivement à une cible.Pour la détection de fluorescence basée sur le signal, la qualité du signal fluorescent est positivement liée à l'ampleur de l'intérêt.L'intensité de la fluorescence est négligeable en l'absence de cible et est détectable lorsqu'une quantité suffisante de cible est présente.Inversement, l'intensité de la fluorescence détectée par la fluorescence "signal off" est inversement proportionnelle à la quantité de cible, atteignant initialement une valeur maximale et diminuant progressivement à mesure que la cible est agrandie.Par exemple, en utilisant le mécanisme de trans-clivage dépendant de la cible CRISPR-Cas13a, Tian et al.[97] ont développé une nouvelle stratégie de reconnaissance pour détecter les ARN qui contournent directement la transcription inverse (Fig. 6a).Lors de la liaison à des ARN cibles complémentaires, le complexe CRISPR-Cas13-ARN peut être activé, déclenchant un clivage transcollatéral par des ARN rapporteurs non spécifiques.Le rapporteur marqué par fluorescence [fluorophore (F)] est désactivé par le désactivateur (Q) intact et devient fluorescent lorsqu'il est clivé par le complexe activé.
L'avantage de la détection électrochimique est la vitesse de détection élevée, la production facile, le faible coût, la facilité de transport et le contrôle automatique.C'est une méthode analytique puissante pour les applications POCT.Basé sur des transistors à effet de champ au graphène Gao et al.[98] ont développé un nanobiocapteur pour la détection multiplex des antigènes de la maladie de Lyme à partir de la bactérie Borrelia burgdorferi avec une limite de détection de 2 pg/mL (Fig. 6b).
Les dosages colorimétriques ont été utilisés dans les applications POCT, bénéficiant des avantages de la portabilité, du faible coût, de la facilité de préparation et de la lecture visuelle.La détection colorimétrique peut utiliser l'oxydation de peroxydase ou de nanomatériaux de type peroxydase, l'agrégation de nanomatériaux et l'ajout de colorants indicateurs pour convertir les informations sur la présence d'acides nucléiques cibles en changements de couleur visibles [99, 100, 101].Notamment, les nanoparticules d'or sont largement utilisées dans le développement de stratégies colorimétriques, et en raison de leur capacité à induire des changements de couleur rapides et significatifs, il existe un intérêt croissant pour le développement de plateformes colorimétriques POCT pour le diagnostic in situ des maladies infectieuses [102].Avec un dispositif microfluidique centrifuge intégré [103], les agents pathogènes d'origine alimentaire dans les échantillons de lait contaminés peuvent être automatiquement détectés au niveau de 10 cellules bactériennes, et les résultats peuvent être lus visuellement en 65 minutes (Fig. 6c).
Les techniques de détection magnétique peuvent détecter avec précision les analytes à l'aide de matériaux magnétiques, et les applications POCT ont suscité un intérêt considérable au cours des dernières décennies.Les techniques de détection magnétique présentent des avantages uniques tels que des matériaux magnétiques à faible coût plutôt que des composants optiques coûteux.Cependant, l'utilisation d'un champ magnétique améliore l'efficacité de la détection et réduit le temps de préparation des échantillons [104].De plus, les résultats du sondage magnétique démontrent une spécificité, une sensibilité et un rapport signal sur bruit élevés en raison du signal de fond magnétique insignifiant des échantillons biologiques [105].Sharma et al.intégré un biocapteur basé sur une jonction tunnel magnétique dans une plate-forme de micropuce portable.[106] pour la détection multiplex d'agents pathogènes (Fig. 6d).Les biocapteurs détectent avec sensibilité les acides nucléiques sous-nanomolaires isolés des agents pathogènes.
Méthode de détection de signal typique.Le concept de détection hyperlocalisée de Cas13a (adapté de [97]).b Nanobiocapteur de graphène FET en combinaison avec Lyme GroES scFv (adapté de [98]).c Indications colorimétriques pour la détection multiplex d'agents pathogènes d'origine alimentaire dans une puce microfluidique centrifuge : échantillons n° 1 et n° 3 avec agents pathogènes cibles, et échantillons n° 2, n° 4 et n° 5 sans agents pathogènes cibles (adapté de [103]) .d Biocapteur basé sur une jonction tunnel magnétique, comprenant une plate-forme, un amplificateur de blocage intégré, une unité de contrôle et une alimentation pour la génération/acquisition du signal (adapté de [106]).GFET Graphène FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS Diméthicone, PMMA polyméthacrylate de méthyle
Malgré les excellentes caractéristiques des méthodes de détection ci-dessus, elles présentent encore des inconvénients.Ces méthodes sont comparées (tableau 1), y compris certaines applications avec des détails (avantages et inconvénients).
Avec le développement de la microfluidique, des systèmes microélectromécaniques, des nanotechnologies et de la science des matériaux, l'utilisation des puces microfluidiques pour la détection des maladies infectieuses ne cesse de progresser [55,96,107,108].La manipulation précise d'équipements et de fluides miniatures contribue à la précision du diagnostic et à la rentabilité.Par conséquent, pour un développement ultérieur, des efforts ont été faits pour optimiser et mettre à niveau les puces, ce qui a abouti à diverses puces microfluidiques avec différentes structures et fonctions.Ici, nous présentons brièvement plusieurs types courants de plateformes microfluidiques et comparons leurs caractéristiques (avantages et inconvénients).De plus, la plupart des exemples énumérés ci-dessous se concentrent principalement sur la lutte contre le SARS-CoV-2.
Les LOCC sont les systèmes analytiques complexes miniaturisés les plus courants et leurs opérations sont hautement miniaturisées, intégrées, automatisées et parallélisées à partir de l'injection et de la préparation des échantillons, du contrôle du débit et de la détection des liquides [109, 110].Les liquides sont manipulés grâce à une géométrie soigneusement conçue et à l'interaction de nombreux effets physiques tels que les gradients de pression, l'action capillaire, l'électrodynamique, les champs magnétiques et les ondes acoustiques [111].LOCC présente d'excellents avantages dans le criblage à haut débit et la détection multiple, avec une vitesse d'analyse rapide, une petite taille d'échantillon, une faible consommation d'énergie et une efficacité de gestion et de fonctionnement élevée ;cependant, les dispositifs LOCC sont très délicats, ainsi que la fabrication, l'emballage et l'interfaçage.Cependant, le multiplexage et la réutilisation rencontrent d'énormes difficultés [96].Par rapport à d'autres plates-formes, LOCC présente des avantages uniques en termes de diversité maximale des applications et de meilleure compatibilité technologique, mais ses inconvénients sont également évidents, à savoir une complexité élevée et une répétabilité médiocre.La dépendance vis-à-vis des pompes externes, qui sont souvent encombrantes et coûteuses, limite encore leur utilisation en POCT.
Pendant l'épidémie de COVID-19, LOCC a reçu beaucoup d'attention.Dans le même temps, il existe plusieurs nouvelles puces qui combinent plusieurs technologies.Par exemple, les smartphones sont désormais largement utilisés comme appareils d'analyse portables et présentent un grand potentiel d'intégration LOCC.Soleil et al.[21] ont fabriqué une puce microfluidique qui permet de multiplexer des séquences d'acides nucléiques spécifiques de cinq agents pathogènes, dont le SRAS-CoV-2, à l'aide de LAMP et de les analyser à l'aide d'un smartphone dans l'heure qui suit la fin de la réaction.Comme autre exemple, Sundah et al.[112] ont créé un commutateur moléculaire [amplification catalytique par commutateur d'état de transition moléculaire (CATCH)] pour la détection directe et sensible des cibles d'ARN du SRAS-CoV-2 à l'aide de smartphones. CATCH est compatible avec le LOCC portable et atteint des performances supérieures (environ 8 copies d'ARN/μl ; < 1 h à température ambiante) [112]. CATCH est compatible avec le LOCC portable et atteint des performances supérieures (environ 8 copies d'ARN/μl ; < 1 h à température ambiante) [112]. Catch совместим с портаtres, locc и обесечивает превосходню пюечваетельносход (прерно 8 копййееее)))))). CATCH est compatible avec le LOCC portable et offre un excellent débit (environ 8 copies d'ARN/µl ; < 1 h à température ambiante) [112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[112]。 CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[112]。 Catch совместиousse с портаtres, LOCC о обладает превосходной производительностюю (примерно 8 коайаа.. .Ййййййййййййййййййййййййййййййййййййййййййй .ййййй р ]йй р ]йй р ]йй р ]йй р ]йй р ]йй р ]йй р ]йй р ]йй у ]йй р ]йй у ]йй у ]ййййййй у). CATCH est compatible avec les LOCC portables et a d'excellentes performances (environ 8 copies d'ARN/µl ; < 1 heure à température ambiante) [112].De plus, les dispositifs LOCC pour le diagnostic moléculaire utilisent également certaines forces motrices telles que le vide, l'étirement et les champs électriques.Kang et al.[113] ont démontré une PCR nanoplasmique sur puce ultra-rapide en temps réel pour un diagnostic rapide et quantitatif du COVID-19 sur le terrain à l'aide d'une puce PCR liquide plasmonique sous vide.Li et al.[114] ont ensuite développé une puce microfluidique à étirement qui a permis le diagnostic de COVID-19.La plateforme utilise le système d'amplification RT-LAMP pour déterminer si un échantillon est qualitativement positif ou négatif.Par la suite, Ramachandran et al.[115] ont obtenu des gradients de champ électrique appropriés en utilisant l'isotachophorèse (ITP), une technique de focalisation sélective des ions mise en œuvre en microfluidique.Avec l'ITP, l'ARN cible des échantillons bruts d'écouvillonnage nasopharyngé peut être automatiquement purifié.Puis Ramachandran et al.[115] La combinaison de cette purification ITP avec des tests LAMP et CRISPR améliorés par ITP a détecté le SRAS-CoV-2 dans un écouvillon nasopharyngé humain et des échantillons cliniques en environ 35 minutes.De plus, de nouvelles idées émergent constamment.Jadhav et al.[116] ont proposé un schéma de diagnostic basé sur la spectroscopie Raman améliorée en surface en combinaison avec un dispositif microfluidique contenant soit des nanotubes de carbone revêtus d'or/argent orientés verticalement, soit des micro/nanotubes électrofilés jetables.Les microcanaux filtrants intégrés fonctionnalisés à la membrane sont jetables.Le dispositif adsorbe les virus de divers fluides corporels/exsudats tels que la salive, le nasopharynx et les larmes.Ainsi, le titre viral est abondant et le virus peut être identifié avec précision par la signature Raman.
LOAD est une plateforme microfluidique centrifuge dans laquelle tous les processus sont contrôlés par un protocole de fréquence qui fait tourner un substrat microstructuré [110].Le dispositif LOAD se caractérise par l'utilisation de la force centrifuge comme force motrice importante.Les liquides sont également soumis aux forces capillaires, d'Euler et de Coriolis.À l'aide d'un dispositif de centrifugation, les analyses sont effectuées en fonctionnement liquide continu d'une position radiale vers l'intérieur vers l'extérieur, éliminant ainsi le besoin de tubes externes supplémentaires, de pompes, d'actionneurs et de vannes actives.En bref, une seule méthode de contrôle simplifie le fonctionnement.Les forces agissant sur le liquide dans le même canal microfluidique à la même distance du centre de charge sont égales, ce qui permet de répéter la structure du canal.Ainsi, l'équipement LOAD est plus simple et plus économique à concevoir et à fabriquer que l'équipement LOCC classique, tandis que les réactions sont largement indépendantes et parallélisées ;cependant, en raison de la résistance mécanique élevée de l'équipement centrifuge, le matériau de copeau disponible est limité et les petits volumes sont difficiles.à la voiture.Dans le même temps, la plupart des dispositifs LOAD sont conçus pour un usage unique, ce qui est coûteux pour une détection à grande échelle [96, 117, 118, 119].
Au cours des dernières décennies, LOAD, considéré comme l'un des dispositifs microfluidiques les plus prometteurs, a reçu une attention considérable de la part des chercheurs et des fabricants.Ainsi, LOAD a été largement accepté et a été utilisé pour le diagnostic moléculaire des agents pathogènes infectieux [120, 121, 122, 123, 124], en particulier lors de l'épidémie de COVID-19.Par exemple, fin 2020, Ji et al.[60] ont démontré un test RT-qPCR direct pour la détection parallèle rapide et automatisée des infections par le SRAS-CoV-2 et la grippe A et B dans des échantillons de prélèvement de gorge.Puis Xiong et al.[74] ont présenté une plateforme microfluidique discoïde intégrée à LAMP pour la détection rapide, précise et simultanée de sept coronavirus respiratoires humains, dont le SRAS-CoV-2, en 40 minutes.Début 2021, de Oliveira et al.[73] ont démontré une puce microfluidique centrifuge de toner en polystyrène, actionnée manuellement avec un rotateur du bout des doigts, pour le diagnostic moléculaire RT-LAMP de COVID-19.Par la suite, Dignan et al.[39] ont présenté un microdispositif centrifuge portable automatisé pour la purification de l'ARN du SRAS-CoV-2 directement à partir de coupes d'écouvillons buccaux.Medved et al.[53] ont proposé un système d'échantillonnage d'aérosols SARS-CoV-2 en ligne avec une puce fluorescente microfluidique rotative de petit volume avec une limite de détection de 10 copies/μL et un seuil de cycle minimum de 15 minutes.Suarez et al.[75] ont récemment rapporté le développement d'une plate-forme microfluidique centrifuge modulaire intégrée pour la détection directe de l'ARN du SRAS-CoV-2 dans des échantillons d'écouvillons nasopharyngés inactivés par la chaleur à l'aide de LAMP.Ces exemples démontrent les grands avantages et la promesse de LOAD dans le diagnostic moléculaire du COVID-19.
En 1945, Muller et Clegg [125] ont présenté pour la première fois des canaux microfluidiques sur papier en utilisant du papier filtre et de la paraffine.En 2007, le groupe Whitesides [126] a créé la première plateforme papier fonctionnelle pour les tests de protéines et de glucose.Le papier est devenu un substrat idéal pour la microfluidique.Le papier a des propriétés inhérentes telles que l'hydrophilie et la structure poreuse, une excellente biocompatibilité, un poids léger, une flexibilité, une capacité de pliage, un faible coût, une facilité d'utilisation et une commodité.Les µPAD classiques sont constitués de structures hydrophiles/hydrophobes construites sur des substrats en papier.Selon la structure tridimensionnelle, les μPAD peuvent être divisés en μPAD bidimensionnels (2D) et tridimensionnels (3D).Les µPAD 2D sont produits en formant des frontières hydrophobes pour former des canaux microfluidiques, tandis que les µPAD 3D sont généralement fabriqués à partir d'empilements de couches de papier microfluidique 2D, parfois par pliage de papier, techniques de glissement, canaux ouverts et impression 3D [96].Les fluides aqueux ou biologiques sur le μPAD sont principalement contrôlés par la force capillaire sans source d'alimentation externe, ce qui facilite le pré-stockage des réactifs, la manipulation des échantillons et la détection multiplex.Cependant, un contrôle de flux précis et une détection multiplex sont entravés par une vitesse de détection, une sensibilité et une réutilisabilité insuffisantes [96, 127, 128, 129, 130].
En tant que plateforme microfluidique inhabituelle, μPAD a été largement promue et développée pour le diagnostic moléculaire de maladies infectieuses telles que le VHC, le VIH et le SRAS-CoV-2 [131, 132].Pour la détection sélective et sensible du VHC, Tengam et al.[133] ont développé un nouveau biocapteur à base de papier fluorescent utilisant une sonde d'acide nucléique hautement spécifique à base de peptide pyrrolidinyle.Les acides nucléiques sont immobilisés de manière covalente sur du papier de cellulose partiellement oxydé par alkylation réductrice entre les groupes amino et les groupes aldéhyde, et la détection est basée sur la fluorescence.Ces signaux peuvent être lus par un gadget spécialement conçu avec une caméra fluorescente portable en combinaison avec une caméra de téléphone portable.Par la suite, Lu et al.[134] ont conçu une électrode flexible à base de papier à base de composites de cadre organométallique de nickel/nanoparticules d'or/nanotubes de carbone/alcool polyvinylique pour la détection de cibles VIH par hybridation d'ADN en utilisant le bleu de méthylène comme indicateur redox d'ADN.Plus récemment, Chowdury et al.[135] ont présenté une conception de plate-forme hypothétique pour les tests µPAD au point de service utilisant la salive brute du patient en combinaison avec la LAMP et la technologie d'imagerie portable pour la détection de l'analyte COVID-19.
Les tests d'écoulement latéral guident les fluides par les forces capillaires et contrôlent le mouvement des fluides par la mouillabilité et les caractéristiques des substrats poreux ou microstructurés.Les dispositifs à flux latéral consistent en un échantillon, un conjugué, un incubateur et une détection, et des tampons absorbants.Les molécules d'acide nucléique dans le LFA reconnaissent des liants spécifiques qui sont pré-stockés au site de liaison et se lient sous forme de complexes.Au fur et à mesure que le liquide passe à travers les plaques d'incubation et de détection, les complexes sont capturés par les molécules de capture situées sur les lignes de test et de contrôle, affichant des résultats qui peuvent être lus directement à l'œil nu.En règle générale, la LFA peut être complétée en 2 à 15 minutes, ce qui est plus rapide que la découverte traditionnelle.En raison du mécanisme spécial, LFA nécessite peu d'opérations et ne nécessite pas d'équipement supplémentaire, ce qui le rend très convivial.Il est facile à fabriquer et à miniaturiser, et le coût des substrats à base de papier est plus faible.Cependant, il n'est utilisé que pour l'analyse qualitative, et la détection quantitative est très difficile, et la capacité de multiplexage et le débit sont très limités, et un seul acide nucléique suffisant peut être détecté à la fois [96, 110, 127].
Bien que la plupart des applications de LFA se concentrent sur les immunoessais, l'utilisation de LFA pour le diagnostic moléculaire dans les puces microfluidiques est également efficace et populaire [136].Dans le cas du virus de l'hépatite B, du VIH et du SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137] ont proposé une plate-forme LFA de nanoparticules de conversion ascendante et ont démontré la polyvalence de cette plate-forme miniaturisée et portable grâce à la détection sensible et quantitative de cibles multiples telles que l'acide nucléique du VHB.De plus, Fu et al.[138] ont démontré un nouveau LFA basé sur la spectroscopie Raman améliorée en surface pour l'analyse quantitative de l'ADN du VIH-1 à de faibles concentrations.Pour une détection rapide et sensible du SARS-CoV-2, Liu et al.[85] ont développé une analyse de flux latéral RPA microfluidique intégrée en combinant RT-RPA et un système universel de détection de flux latéral dans un seul système microfluidique.
L'application de diverses plates-formes microfluidiques varie en fonction des études spécifiques, tirant pleinement parti des capacités et des avantages des plates-formes.Avec des vannes, des pompes et des conduits abordables, LOCC est la plate-forme la plus complète pour la diversité et l'interopérabilité des applications avec la plus grande marge de développement.Par conséquent, nous espérons et recommandons que les études les plus récentes soient menées au LOCC dans un premier temps et que les conditions soient optimisées.En outre, des méthodes plus efficaces et plus précises devraient être découvertes et utilisées dans le système.LOAD excelle dans le contrôle précis des fluides des dispositifs LOCC existants et présente des avantages uniques dans les entraînements uniques par force centrifuge sans avoir besoin d'entraînements externes, tandis que les réponses parallèles peuvent être séparées et synchronisées.Ainsi, à l'avenir, LOAD deviendra la principale plateforme microfluidique avec moins d'opérations manuelles et des technologies plus matures et automatisées.La plate-forme µPAD combine les avantages du LOCC et des matériaux à base de papier pour des diagnostics à usage unique et à faible coût.Par conséquent, le développement futur devrait se concentrer sur des technologies pratiques et bien établies.De plus, le LFA est bien adapté à la détection à l'œil nu, promettant de réduire la consommation d'échantillons et d'accélérer la détection.Une comparaison détaillée des plates-formes est présentée dans le tableau 2.
Les analyses numériques divisent l'échantillon en plusieurs microréacteurs, chacun contenant un nombre discret de molécules cibles [139, 140].Les tests numériques offrent des avantages significatifs pour effectuer une quantification absolue en effectuant des milliers d'expériences biochimiques parallèles simultanément et individuellement dans des compartiments à l'échelle du micron plutôt qu'en phase continue.Par rapport à la microfluidique traditionnelle, les réactions de compartiment peuvent réduire le volume d'échantillon, augmenter l'efficacité de la réaction et être facilement intégrées à d'autres méthodes analytiques sans avoir besoin de canaux, de pompes, de vannes et de conceptions compactes [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147] .Les deux méthodes suivantes sont utilisées dans les dosages numériques pour obtenir une séparation uniforme et précise des solutions, y compris des réactifs et des échantillons tels que des cellules, des acides nucléiques et d'autres particules ou molécules : (1) gouttes d'émulsions exploitant l'instabilité de l'interface liquide ;(2) la division du réseau est effectuée par les contraintes géométriques du dispositif.Dans la première méthode, des gouttelettes contenant des réactifs et des échantillons dans des microcanaux peuvent être créées par des méthodes passives telles que le co-courant, le flux croisé, la focalisation de flux, l'émulsification par étapes, l'émulsification de microcanaux et les membranes par des forces de cisaillement visqueuses et une émulsification avec changement de canal.localisation [143, 145, 146, 148, 149] ou par des méthodes actives [150, 151], qui introduisent de l'énergie supplémentaire par contrôle électrique, magnétique, thermique et mécanique.Dans cette dernière approche, la meilleure uniformité du volume de fluide dans les chambres microfluidiques est partagée en gardant les structures spatiales de la même taille, telles que les micropuits et les réseaux de surface [152, 153, 154].Notamment, les gouttelettes sont des sections d'écoulement majeures qui peuvent également être générées et manipulées sur des réseaux d'électrodes basés sur la microfluidique numérique (DMF).L'électromouillage des diélectriques est l'une des théories DMF les mieux étudiées, car l'électromouillage des diélectriques permet une manipulation précise des gouttes individuelles, en contrôlant la forme du liquide et des signaux électriques asymétriques traversant différents côtés [141, 144].Les principales opérations avec des gouttelettes dans le DMF comprennent le tri, la séparation et la fusion [151, 155, 156], qui peuvent être appliquées dans divers domaines d'analyse, notamment en détection moléculaire [157, 158, 159].
La détection numérique des acides nucléiques est une technologie de diagnostic moléculaire de troisième génération après la PCR conventionnelle et la PCR quantitative en temps réel (qPCR), en parallèle avec le séquençage à haut débit et la biopsie liquide.Au cours des deux dernières décennies, les acides nucléiques numériques se sont rapidement développés dans le domaine du diagnostic moléculaire des pathogènes infectieux [160, 161, 162].La quantification absolue de la détection numérique des acides nucléiques commence par le conditionnement des échantillons et des réactifs dans des compartiments individuels pour garantir que chaque séquence cible a la même probabilité d'entrer dans chaque compartiment individuel.Théoriquement, chaque section peut se voir attribuer plusieurs séquences cibles, ou il peut ne pas y avoir de système de microréaction indépendant.Grâce aux divers mécanismes de détection décrits ci-dessus, les compartiments avec des séquences cibles microbiennes qui génèrent des signaux au-dessus d'un certain seuil peuvent être visualisés à l'œil nu ou par une machine et sont étiquetés comme positifs, tandis que d'autres compartiments qui génèrent des signaux en dessous du seuil sont étiquetés comme positifs. .les négatifs, qui font du signal de chaque section un booléen.Ainsi, en calculant le nombre de compartiments créés et le taux de résultats positifs après la réaction, les copies originales des échantillons de test peuvent être appariées à l'aide de la formule de distribution de Poisson sans avoir besoin d'une courbe standard, qui est requise pour les analyses quantitatives de routine telles que comme qPCR.[163] Par rapport aux méthodes de diagnostic moléculaire traditionnelles, la détection numérique des acides nucléiques a un degré d'automatisation plus élevé, une vitesse et une sensibilité d'analyse plus élevées, moins de réactifs, moins de contamination et une conception et une fabrication plus simples.Pour ces raisons, l'utilisation de tests numériques, en particulier de méthodes basées sur des gouttes, pour le diagnostic moléculaire, combinant des techniques d'amplification et de lecture du signal, a été bien étudiée lors de l'épidémie critique de SRAS-CoV-2.Par exemple, Yin et al.[164] ont combiné les méthodes numériques de gouttelettes et PCR rapide pour détecter les gènes ORF1ab, N et RNase P dans le SRAS-CoV-2 dans une puce microfluidique.Notamment, le système a pu identifier un signal positif en 115 secondes, ce qui est plus rapide que la PCR conventionnelle, indiquant son efficacité dans la détection au point de service (Figure 7a).Dong et al.[165], Sow et al.[157], Chen et al.[166] et Alteri et al.[167] ont également appliqué la PCR numérique en gouttelettes (ddPCR) pour détecter le SRAS-CoV-2 dans un système microfluidique avec des résultats impressionnants.Pour améliorer encore le taux de détection, Shen et al.[168] ont réalisé une imagerie de puce basée sur la ddPCR en aussi peu que 15 s sans l'utilisation de techniques d'assemblage d'images, accélérant le processus de la technologie ddPCR du laboratoire à l'application.Non seulement des méthodes d'amplification thermique telles que la PCR sont appliquées, mais également des méthodes d'amplification isotherme sont utilisées pour simplifier les conditions de réaction et une réponse rapide.Lu et al.[71] ont développé SlipChip pour l'analyse des gouttelettes, capable de générer des gouttelettes de différentes tailles à des densités élevées en une seule étape et de quantifier les acides nucléiques du SRAS-CoV-2 à l'aide de LAMP numérique (Figure 7b).En tant que technologie en évolution rapide, CRISPR peut également jouer un rôle important dans la détection numérique des acides nucléiques grâce à une imagerie colorimétrique pratique sans avoir besoin de colorants d'acide nucléique supplémentaires.Ackermann et al.développé une réaction matricielle combinatoire pour l'évaluation multiplex des acides nucléiques.[158] ont détecté 169 virus associés à l'homme, y compris le SRAS-CoV-2, dans des gouttelettes contenant des réactifs de détection d'acide nucléique à base de CRISPR-Cas13 dans un test au micropuits (Figure 7c).De plus, l'amplification isotherme et la technologie CRISPR peuvent être utilisées dans le même système pour combiner les avantages des deux.Parc et al.[169] Un test numérique CRISPR/Cas12a a été développé dans une puce microfluidique commerciale pour la détection du SRAS-CoV-2 extrait et tué par la chaleur sur la base d'une RT-RPA en une seule étape avec une détection du signal à l'arrière-plan plus courte et plus élevée rapport de temps., plage dynamique plus large et meilleure sensibilité (Fig. 7d).Certaines descriptions de ces exemples sont données dans le tableau 3.
Plate-forme numérique typique pour la détection d'acide nucléique.a Le flux de travail PCR numérique rapide comprend quatre étapes clés : préparation de l'échantillon, distribution du mélange réactionnel, processus d'amplification et quantification de la cible (adapté de [164]).b Schéma montrant l'analyse des gouttelettes SlipChip pour la formation de gouttelettes à haute densité (adapté de [71]).c Diagramme de workflow CARMEN-Cas13 (adapté de [158]).d Aperçu de la détection avancée des virus numériques avec CRISPR/Cas dans un pot (adapté de [169]).W/O eau-dans-huile, polydiméthylsiloxane PDMS, amplification en chaîne par polymérase PCR, collecte de données DAQ, dérivé intégral proportionnel PID, réaction matricielle combinatoire CARMEN pour l'évaluation multiplex des acides nucléiques, SARS-CoV-2, syndrome respiratoire aigu sévère, coronavirus 2 , Amplification RT de la transcriptase inverse recombinase polymérase-RPA, signal S/B en arrière-plan