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Les méthodes de marquage de proximité enzymatique basées sur des esters activés ou des radicaux phénoxy sont largement utilisées pour cartographier les protéomes subcellulaires et les interactions protéiques dans les cellules vivantes.Cependant, les esters activés sont moins réactifs, ce qui entraîne un large rayon de marquage, et les radicaux phénoxy générés par le traitement au peroxyde peuvent interférer avec les voies redox.Nous rapportons ici une méthode de photoactivation dépendante de l'étiquetage de proximité (PDPL) développée en liant génétiquement la protéine photosensibilisante miniSOG à une protéine d'intérêt.Déclenché par la lumière bleue et contrôlé par le temps d'exposition, l'oxygène singulet est généré, puis le marquage spatio-temporellement résolu des résidus d'histidine par la sonde d'aniline est réalisé.Nous démontrons sa haute fidélité grâce à la cartographie du protéome spécifique aux organites.Une comparaison côte à côte de PDPL avec TurboID montre une couverture protéomique plus spécifique et complète de PDPL.Ensuite, nous avons appliqué PDPL au coactivateur transcriptionnel associé à la maladie BRD4 et E3 Parkin ligase et avons trouvé des interacteurs jusque-là inconnus.Par criblage de surexpression, deux substrats inconnus, Ssu72 et SNW1, ont été identifiés pour Parkin, dont la dégradation est médiée par la voie ubiquitination-protéasome.
La caractérisation précise des réseaux de protéines sous-tend de nombreux processus cellulaires fondamentaux.Par conséquent, une cartographie spatio-temporelle très précise des interactions protéiques fournira une base moléculaire pour déchiffrer les voies biologiques, la pathologie de la maladie et perturber ces interactions à des fins thérapeutiques.A cette fin, des méthodes capables de détecter des interactions temporelles dans des cellules ou des tissus vivants sont hautement souhaitables.La spectrométrie de masse par purification d'affinité (AP-MS) a toujours été utilisée pour identifier les partenaires de liaison des protéines d'intérêt (POI).Avec le développement des méthodes de protéomique quantitative, Bioplex3.0 a été créé, la plus grande base de données de réseaux de protéines basée sur AP-MS.Bien que l'AP-MS soit très puissant, les étapes de lyse et de dilution des cellules dans le flux de travail sont biaisées vers des interactions de liaison faibles et transitoires et introduisent des artefacts post-lyse tels que des paires d'interactions parasites qui manquent de compartimentation avant la lyse.
Pour résoudre ces problèmes, des acides aminés non naturels (UAA) avec des groupes de réticulation et des plateformes de marquage enzymatique à proximité (PL) (par exemple APEX et BioID)5 ont été développés.Bien que la méthode UAA ait été appliquée avec succès dans de nombreux scénarios et fournisse des informations sur les adhésifs protéiques directs, l'optimisation du site d'insertion UAA est toujours nécessaire.Plus important encore, il s'agit d'une méthode d'étiquetage stoechiométrique dépourvue d'inversion catalytique des événements d'étiquetage.En revanche, les méthodes PL enzymatiques, telles que la méthode BioID, fusionnent la biotine ligase modifiée à POI7, qui active ensuite la biotine pour former un intermédiaire réactif biotinyl-AMP ester.L'enzyme catalyse et libère ainsi un « nuage » de biotine activé qui marque les résidus de lysine proximaux.Cependant, BioID nécessite plus de 12 heures pour obtenir un signal marqué suffisant, ce qui exclut son utilisation avec une résolution temporelle.En utilisant l'évolution dirigée basée sur l'affichage de la levure, TurboID a été conçu sur la base de BioID pour être plus efficace, permettant un marquage efficace avec de la biotine en 10 minutes, permettant d'étudier des processus plus dynamiques.Étant donné que TurboID est hautement actif et que les niveaux de biotine endogène sont suffisants pour un étiquetage de bas niveau, l'étiquetage de fond devient un problème potentiel lorsqu'un étiquetage hautement amélioré et chronométré est requis par l'ajout de biotine exogène.De plus, les esters activés sont peu réactifs (t1/2 ~ 5 min), ce qui peut conduire à un grand rayon de marquage, en particulier après saturation des protéines voisines avec la biotine 5. Dans une autre approche, la fusion génétique de l'ascorbate peroxydase modifiée (c'est-à-dire biotine- radicaux phénol et permet le marquage des protéines en une minute 9, 10. APEX est largement utilisé pour identifier les protéomes subcellulaires, les complexes de protéines membranaires et les complexes de protéines de signalisation cytosoliques 11, 12. Cependant, le besoin de concentrations élevées de peroxydes peut affecter les protéines ou les voies redox, perturbant processus cellulaires.
Ainsi, une nouvelle méthode capable de générer des espèces de suppression de rayon marqué plus réactives avec une grande précision spatiale et temporelle sans perturber de manière significative les voies cellulaires sera un ajout important aux méthodes existantes. Parmi les espèces réactives, l'oxygène singulet a retenu notre attention en raison de sa courte durée de vie et de son rayon de diffusion limité (t1/2 < 0,6 µs dans les cellules)13. Parmi les espèces réactives, l'oxygène singulet a retenu notre attention en raison de sa courte durée de vie et de son rayon de diffusion limité (t1/2 < 0,6 µs dans les cellules)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. Parmi les formes actives, l'oxygène singulet a retenu notre attention en raison de sa courte durée de vie et de son rayon de diffusion limité (t1/2 < 0,6 µs dans les cellules)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0.6 µs）而引起了我们的注意13も 1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). Parmi les formes actives, l'oxygène singulet retient notre attention en raison de sa courte durée de vie et de son rayon de diffusion limité (t1/2 < 0,6 μs dans les cellules).Il a été rapporté que l'oxygène singulet oxyde de manière aléatoire la méthionine, la tyrosine, l'histidine et le tryptophane, le rendant polaire 14,15 pour la fixation à des sondes à base d'amine ou de thiol16,17.Bien que l'oxygène singulet ait été utilisé pour marquer l'ARN du compartiment sous-cellulaire, les stratégies de réaffectation des marqueurs de proximité POI endogènes restent inexplorées.Ici, nous présentons une plate-forme appelée étiquetage de proximité dépendant de la photoactivation (PDPL), où nous utilisons la lumière bleue pour éclairer les POI fusionnés avec un photosensibilisateur miniSOG et déclencher la génération d'oxygène singulet pour oxyder les résidus proximaux, suivie de modifications contenant des amines pour oxyder les sondes chimiques dans cellules vivantes intermédiaires..Nous avons testé un groupe de sondes chimiques pour maximiser la spécificité des balises et identifié les sites de modification à l'aide d'un flux de travail protéomique ouvert.Une comparaison côte à côte de PDPL avec TurboID montre une couverture protéomique plus spécifique et complète de PDPL.Nous avons appliqué cette approche à des marqueurs spécifiques aux organites du protéome subcellulaire et à l'identification du protéome général des partenaires de liaison pour la protéine régulatrice épigénétique associée au cancer BRD4 et la ligase E3 associée à la maladie de Parkinson Parkin, ce qui a confirmé à la fois un réseau connu et inconnu de protéines. interactions..La capacité de PDPL à reconnaître les substrats E3 dans de grands complexes protéiques représente une situation où la reconnaissance des liants indirects est nécessaire.Deux substrats de parkine inconnus médiés par l'ubiquitination-protéasome ont été confirmés in situ.
La thérapie photodynamique (PDT)19 et l'inactivation laser assistée par chromophore (CALI)20, dans lesquelles l'irradiation lumineuse avec des photosensibilisateurs génère de l'oxygène singulet, peuvent inactiver les protéines cibles ou provoquer la mort cellulaire.Étant donné que l'oxygène singulet est une substance hautement réactive avec une distance de diffusion théorique d'environ 70 nm, une oxydation spatialement limitée autour du photosensibilisateur peut être contrôlée.Sur la base de ce concept, nous avons décidé d'utiliser l'oxygène singulet pour obtenir un marquage précis des complexes protéiques dans les cellules vivantes.Nous avons développé une approche chimioprotéomique PDPL pour remplir quatre fonctions : (1) catalyser la génération d'oxygène singulet actif similaire à l'approche enzymatique PL ;(2) fournir un étiquetage résolu dans le temps lors de l'initiation de la lumière ;(3) par altération (4) Évitez d'utiliser des cofacteurs endogènes (tels que la biotine) pour réduire le bruit de fond, ou utilisez des réactifs exogènes hautement perturbateurs (tels que les peroxydes) pour minimiser l'exposition des cellules au stress environnemental.
Les photosensibilisateurs peuvent être divisés en deux catégories, à savoir les fluorophores de faible poids moléculaire (par exemple, le rose bengale, le bleu de méthylène)22 et les petites protéines génétiquement codées (par exemple, miniSOG, KillerRed)23.Pour obtenir une conception modulaire, nous avons développé la plate-forme PDPL de première génération en ajoutant des protéines photosensibilisantes (PS) à POI24,25 (Figure 1a).Lorsqu'il est irradié avec de la lumière bleue, l'oxygène singulet oxyde les résidus d'acides aminés nucléophiles proximaux, ce qui entraîne une polarité umpolung qui est électrophile et peut encore réagir avec les nucléophiles des sondes amines16,17.La sonde est conçue avec une poignée en alcyne pour permettre la chimie du clic et la traction vers le bas pour la caractérisation LC/MS/MS.
Illustration schématique de l'étiquetage des complexes protéiques médiés par miniSOG.Lorsqu'elles sont exposées à la lumière bleue, les cellules exprimant miniSOG-POI génèrent de l'oxygène singulet, qui modifie les protéines en interaction mais pas les protéines non contraignantes.Les produits intermédiaires de la photooxydation sont interceptés par des marqueurs relais de la sonde chimique amine pour former des adduits covalents.Le groupe alcynyle sur la sonde chimique permet une chimie de clic pour l'enrichissement par pull-down suivi d'une quantification LC-MS/MS.b Structure chimique des sondes amine 1-4.c Analyse représentative sur gel fluorescent de marqueurs protéomiques médiés par miniSOG localisés dans les mitochondries à l'aide des sondes 1 à 4 et quantification relative basée sur la densitométrie sur gel.Le rapport signal sur fond des sondes chimiques a été évalué à l'aide d'expériences de contrôle négatif excluant la lumière bleue ou à l'aide de cellules HEK293T sans expression de miniSOG.n = 2 échantillons biologiquement indépendants.Chaque point représente une réplique biologique.d Détection et quantification représentatives de PDPL à l'aide de la sonde optimisée 3 en présence ou en l'absence des composants PDPL indiqués comme c.n = 3 échantillons biologiquement indépendants.Chaque point représente une réplique biologique.Les traits d'axe et les moustaches représentent la moyenne et ± l'écart type.CBB : bleu brillant de Coomassie.e Imagerie confocale de l'oxygène singulet avec une coloration Si-DMA rouge lointain.Barre d'échelle : 10 µm.L'imagerie sur gel et les expériences confocales ont été répétées indépendamment au moins deux fois avec des résultats similaires.
Nous avons d'abord testé la capacité des photosensibilisateurs matures miniSOG26 et KillerRed23, exprimés de manière stable dans HEK293T, à médier le marquage à la propargylamine du protéome en tant que sonde chimique (Fig. 1a supplémentaire).L'analyse de fluorescence sur gel a montré que le marquage du protéome entier a été obtenu en utilisant miniSOG et une irradiation à la lumière bleue, alors qu'aucun produit de marquage visible n'a été observé avec KillerRed.Pour améliorer le rapport signal sur fond, nous avons ensuite testé un ensemble de sondes chimiques contenant de l'aniline (1 et 3), de la propylamine (2) ou de la benzylamine (4).Nous avons observé que les cellules HEK293T elles-mêmes avaient un signal de fond plus élevé par rapport à l'absence de lumière bleue, peut-être en raison du photosensibilisateur endogène à la riboflavine, la flavine mononucléotide (FMN) 27 . Les sondes chimiques à base d'aniline 1 et 3 ont donné une meilleure spécificité, HEK293T exprimant de manière stable miniSOG dans les mitochondries affichant une augmentation > 8 fois du signal pour la sonde 3, tandis que la sonde 2 utilisée dans la méthode de marquage d'ARN CAP-seq n'affichant que ~ 2,5- multiplication du signal, probablement en raison de préférences de réactivité différentes entre l'ARN et la protéine (Fig. 1b, c). Les sondes chimiques à base d'aniline 1 et 3 ont donné une meilleure spécificité, HEK293T exprimant de manière stable miniSOG dans les mitochondries affichant une augmentation > 8 fois du signal pour la sonde 3, tandis que la sonde 2 utilisée dans la méthode de marquage d'ARN CAP-seq n'affichant que ~ 2,5- multiplication du signal, probablement en raison de préférences de réactivité différentes entre l'ARN et la protéine (Fig. 1b, c).Les sondes chimiques à base d'aniline 1 et 3 ont montré une meilleure spécificité : HEK293T, qui exprime de manière stable miniSOG dans les mitochondries, montre une augmentation de plus de 8 fois du signal pour la sonde 3, tandis que la sonde 2, utilisée dans la méthode de marquage de l'ARN CAP-seq, ne montre une augmentation du signal d'environ 2, 5 fois, probablement en raison de préférences de réactivité différentes entre l'ARN et la protéine (Fig. 1b, c).基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 好 的 特异性 ， HEK293T 在 线 粒体 中 稳定 表达 MINISOG ， 探针 3 的 信号 增加> 8 倍 ， 而 用 于 RNA 标记 方法 CAP-SEQ 的 探针 2 仅 显示 而 用 于 RNA 标记 方法 CAP-SEQ 的 探针 2 仅 ~ ~ 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 ， HEK293T 在 粒体 中 稳定 表达 MINISOG ， 探针 3 的 信号 增加 增加> 8 倍 而 于 于 RNA 标记 Cap-eq 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ 2,5 -倍信号增加，可能是由于ARNLes sondes chimiques à base d'aniline 1 et 3 avaient une meilleure spécificité, HEK293T exprimait de manière stable le miniSOG dans les mitochondries, et la sonde 3 avait une augmentation de plus de 8 fois du signal, tandis que la sonde 2 pour la méthode de marquage de l'ARN CAP-seq n'a montré qu'une augmentation d'environ 2,5 fois.dans le signal, probablement en raison de préférences de réaction différentes entre l'ARN et la protéine (Fig. 1b, c).De plus, les isomères de la sonde 3 et les sondes d'hydrazine (sondes 5, 6, 7) ont été testés, confirmant l'optimisation de la sonde 3 (Fig. 1b, c supplémentaires).De même, l'analyse de fluorescence en gel a révélé d'autres paramètres expérimentaux optimisés: longueur d'onde d'irradiation (460 nm), concentration de la sonde chimique (1 mM) et durée d'irradiation (20 min) (Fig. 2a – c supplémentaires).L'omission de tout composant ou étape dans le protocole PDPL a entraîné une inversion significative du signal vers l'arrière-plan (Fig. 1d).Notamment, le marquage des protéines a été significativement réduit en présence d'azoture de sodium ou de trolox, qui sont connus pour éteindre l'oxygène singulet.La présence de D2O, qui est connu pour stabiliser l'oxygène singulet, améliore le signal de marquage.Pour étudier la contribution d'autres espèces réactives de l'oxygène au marquage, du mannitol et de la vitamine C ont été ajoutés pour établir des piégeurs de radicaux hydroxyle et superoxyde, respectivement, 18, 29, mais ils ne se sont pas avérés réduire le marquage.L'ajout de H2O2, mais pas d'éclairage, n'a pas entraîné d'étiquetage (Fig. 3a supplémentaire).L'imagerie de l'oxygène singulet par fluorescence avec des sondes Si-DMA a confirmé la présence d'oxygène singulet dans le fil HEK293T-miniSOG, mais pas dans le fil HEK293T d'origine.De plus, mitoSOX Red n'a pas pu détecter la production de superoxyde après illumination (Fig. 1e et Fig. 3b supplémentaire) 30. Ces données suggèrent fortement que l'oxygène singulet est la principale espèce d'oxygène réactif responsable du marquage protéomique ultérieur.La cytotoxicité du PDPL a été évaluée, y compris l'irradiation à la lumière bleue et les sondes chimiques, et aucune cytotoxicité significative n'a été observée (Fig. 4a supplémentaire).
Afin d'étudier le mécanisme de marquage et de permettre l'identification protéomique des complexes protéiques à l'aide de LC-MS/MS, nous devons d'abord déterminer quels acides aminés sont modifiés et la masse delta des marqueurs de sonde.Il a été rapporté que la méthionine, l'histidine, le tryptophane et la tyrosine sont modifiés par l'oxygène singulet14,15.Nous intégrons le flux de travail TOP-ABPP31 avec la recherche ouverte impartiale fournie par la plate-forme informatique FragPipe basée sur MSFragger32.Après la modification de l'oxygène singulet et le marquage de la sonde chimique, la chimie du clic a été réalisée à l'aide d'un marqueur de réduction de biotine contenant un lieur clivable, suivi d'un étirement de la neutravidine et d'une digestion à la trypsine.Le peptide modifié, toujours lié à la résine, a été photoclivé pour l'analyse LC-MS/MS (figure 2a et données supplémentaires 1).Un grand nombre de modifications se sont produites dans tout le protéome avec plus de 50 correspondances de cartes peptidiques (PSM) répertoriées (Fig. 2b).De manière surprenante, nous n'avons observé que la modification de l'histidine, probablement en raison de la plus grande réactivité de l'histidine oxydée envers les sondes d'aniline que les autres acides aminés.Selon le mécanisme publié de l'oxydation de l'histidine par l'oxygène singulet,21,33 la structure de masse delta proposée de +229 Da correspond à l'adduit de la sonde 3 avec la 2-oxo-histidine après deux oxydations, tandis que +247 Da est le produit d'hydrolyse de +229 Da (Fig. 5 supplémentaire).L'évaluation du spectre MS2 a montré une grande fiabilité d'identification de la plupart des ions y et b, y compris l'identification des ions fragments modifiés (y et b) (Fig. 2c).L'analyse contextuelle de la séquence locale des histidines modifiées par PDPL a révélé une préférence de motif modérée pour les petits résidus hydrophobes à ± 1 positions (Fig. 4b supplémentaire).En moyenne, 1,4 histidines ont été identifiées par protéine et les sites de ces marqueurs ont été déterminés par analyse de la surface accessible au solvant (SASA) et de la disponibilité relative du solvant (RSA) (Fig. 4c, d supplémentaires).
Un flux de travail impartial pour étudier la sélectivité résiduelle à l'aide de la plate-forme informatique FragPipe optimisée par MSFragger.Les lieurs clivables sont utilisés dans la chimie Click pour permettre le photoclivage des peptides modifiés à partir de la résine de streptavidine.Une recherche ouverte a été lancée pour identifier de nombreuses modifications, ainsi que des vestiges pertinents.b Attribuez la masse de modifications se produisant dans tout le protéome.Cartographie peptidique PSM.c Annotation spectrale MS2 des sites d'histidine modifiés avec la sonde 3. À titre d'exemple représentatif, une réaction covalente avec la sonde 3 a ajouté +229,0938 Da à l'acide aminé modifié.d Test de mutation utilisé pour tester les marqueurs PDPL.PRDX3 (H155A, H225A) et PRDX1 (H10A, H81A, H169A) ont été transfectés avec des plasmides de type sauvage pour la détection anti-Flag.e Le peptide synthétique a été mis à réagir avec du miniSOG purifié en présence de la sonde 3 et les produits correspondants avec Δm +247 et +229 ont été notés dans le spectre LC-MS.f Interactions protéine-à-protéine in vitro modélisées avec miniSOG-6xHis-tag et anticorps anti-6xHis.Analyse antibiotine (streptavidine-HRP) et Western blot anti-souris des complexes d'anticorps miniSOG-6xHis/anti-6xHis marqués avec la sonde 3, en fonction du temps d'exposition à la lumière.Les marqueurs des protéines individuelles sont exprimés dans le poids moléculaire correspondant : chaîne légère d'anticorps LC, chaîne lourde d'anticorps HC.Ces expériences ont été répétées indépendamment au moins deux fois avec des résultats similaires.
Pour la vérification biochimique du site de marquage, PRDX3 et PRDX1 identifiés par spectrométrie de masse ont été changés de l'histidine à l'alanine et comparés au type sauvage dans les tests de transfection.Les résultats du PDPL ont montré que la mutation réduisait considérablement le marquage (Fig. 2d).Pendant ce temps, les séquences peptidiques identifiées dans la recherche ouverte ont été synthétisées et mises à réagir in vitro avec du miniSOG purifié en présence de la sonde 3 et de la lumière bleue, donnant des produits avec un déplacement de masse de +247 et +229 Da lorsqu'ils sont détectés par LC-MS (Fig. .2e).).Pour tester si les protéines proximales en interaction pouvaient être marquées in vitro en réponse à la photoactivation miniSOG, nous avons conçu un test de proximité artificielle par interaction entre la protéine miniSOG-6xHis et un anticorps monoclonal anti-His in vitro (Figure 2f).Dans cet essai, nous nous attendions à un marquage proximal des chaînes lourdes et légères d'anticorps avec miniSOG.En fait, les Western blots anti-souris (reconnaissant les chaînes lourdes et légères de l'anticorps marqué anti-6xHis) et à la streptavidine ont montré une forte biotinylation des chaînes lourdes et légères.Notamment, nous avons remarqué une autobiotinylation miniSOG due à l'étiquette 6xHis et aux liens croisés entre les chaînes légères et lourdes, ce qui peut être lié à l'écart décrit précédemment entre la réponse proximale de la lysine et de la 2-oxo-histidine.En conclusion, nous concluons que PDPL modifie l'histidine de manière dépendante de la proximité.
Notre prochain objectif était de caractériser le protéome subcellulaire pour tester la spécificité du marquage in situ.Par conséquent, nous avons exprimé de manière stable miniSOG dans le noyau, la matrice mitochondriale ou la membrane ER externe des cellules HEK293T (Fig. 3a).L'analyse de fluorescence sur gel a révélé d'abondantes bandes marquées à trois emplacements subcellulaires ainsi que différents modèles de marquage (Fig. 3b).L'analyse par imagerie de fluorescence a montré une spécificité élevée de PDPL (Fig. 3c).Le flux de travail PDPL a été suivi de réactions de clic avec des colorants à la rhodamine pour délimiter les protéomes subcellulaires à l'aide de la microscopie à fluorescence, et les signaux PDPL ont été colocalisés avec DAPI, des trackers mitochondriaux ou des trackers ER, confirmant la haute fidélité de PDPL.Pour les trois emplacements d'organites, une comparaison côte à côte de PDPL avec TurboID en utilisant l'avidine western blot a montré que PDPL était étiqueté plus spécifiquement par rapport à leurs témoins respectifs.Dans des conditions PDPL, davantage de bandes marquées sont apparues, indiquant davantage de protéines marquées au PDPL (Fig. 6a-d supplémentaires).
a Représentation schématique du marquage du protéome spécifique aux organites médié par miniSOG.miniSOG cible la matrice mitochondriale via la fusion aux 23 acides aminés N-terminaux du COX4 humain (mito-miniSOG), le noyau via la fusion à H2B (noyau-miniSOG) et Sec61β via le côté cytoplasmique de la membrane ER (ER-miniSOG ).Les indications comprennent l'imagerie sur gel, l'imagerie confocale et la spectrométrie de masse.b Images de gel représentatives de trois profils PDPL spécifiques aux organites.CBB Coomassie Bleu Brillant.c Images confocales représentatives de cellules HEK293T exprimant de manière stable miniSOG avec différentes localisations subcellulaires détectées par un anticorps marqué V5 (rouge).Des marqueurs subcellulaires sont utilisés pour les mitochondries et le RE (vert).Le flux de travail PDPL comprend la détection de protéomes subcellulaires marqués miniSOG (jaune) à l'aide de la chimie du clic Cy3-azide.Barre d'échelle : 10 µm.d Parcelles volcaniques de protéomes marqués PDPL dans divers organites quantifiés par quantification non marquée (n = 3 expériences biologiques indépendantes).Le test t de Student bilatéral a été utilisé sur les parcelles de volcan.Le type sauvage HEK293T a été utilisé comme contrôle négatif. Les protéines significativement modifiées sont surlignées en rouge (p < 0,05 et > 2 fois la différence d'intensité des ions). Les protéines significativement modifiées sont surlignées en rouge (p < 0,05 et > 2 fois la différence d'intensité des ions). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсив ). Les protéines significativement modifiées sont surlignées en rouge (p < 0,05 et > 2 fois la différence d'intensité ionique).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной сионной сионной сионной). Les protéines significativement altérées sont surlignées en rouge (p < 0,05 et > 2 fois la différence de force ionique).Les protéines apparentées importantes pour HEK293T-miniSOG mais non importantes pour HEK293T sont indiquées en vert.e Analyse de la spécificité des ensembles de données protéomiques d'expériences d.Le nombre total de protéines statistiquement significatives dans chaque organite (points rouges et verts) est marqué en haut.Les histogrammes montrent des protéines localisées dans des organites basées sur MitoCarta 3.0, analyse GO et A. Ting et al.personnes.Ensembles de données séparés pour les mitochondries, les noyaux et les ER.Ces expériences ont été répétées indépendamment au moins deux fois avec des résultats similaires.Les données brutes sont fournies sous forme de fichiers de données brutes.
Encouragée par les résultats du gel et de l'imagerie, une quantification sans étiquette a été utilisée pour quantifier le protéome identifié dans chaque organite (Données supplémentaires 2).HEK293T non transfecté a été utilisé comme contrôle négatif pour soustraire les marqueurs de fond. L'analyse des parcelles volcaniques a montré des protéines significativement enrichies (p <0, 05 et> 2 fois l'intensité des ions) ainsi que des protéines singleton qui ne sont présentes que dans les lignées exprimant miniSOG (Fig. 3d points rouges et verts). L'analyse des parcelles volcaniques a montré des protéines significativement enrichies (p <0, 05 et> 2 fois l'intensité des ions) ainsi que des protéines singleton qui ne sont présentes que dans les lignées exprimant miniSOG (Fig. 3d points rouges et verts). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). L'analyse des parcelles volcaniques a montré des protéines significativement enrichies (p <0, 05 et> 2 fois l'intensité des ions) ainsi que des protéines uniques qui ne sont présentes que dans les lignées exprimant miniSOG (Fig. 3d, points rouges et verts).火山图 分析 显示 出 显着 富集 的 蛋白质 （P <0,05 和> 2 倍 离子 强度） 以及 仅 存 在于 MINISOG 表达 系 中 的 单一 蛋白质 （图 3D 红色 和））。火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 （P <0,05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 存 在于 在于 MINISOG 表达 系 的 单一 蛋白质 （图 3D 红色 绿色点 。。。））））））））））） 。。。）））））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). L'analyse du tracé volcanique a révélé des protéines considérablement enrichies (p <0, 05 et> 2x force ionique) ainsi que des protéines uniques présentes uniquement dans la ligne d'expression miniSOG (points rouges et verts sur la figure 3d).En combinant ces données, nous avons identifié respectivement 1364, 461 et 911 protéines de membrane externe nucléaires, mitochondriales et ER statistiquement significatives.Pour analyser la précision de la PDPL localisée dans les organites, nous avons utilisé MitoCarta 3.0, l'analyse Gene Ontology (GO) et A. Ting et al.un ensemble de données8 a été utilisé pour les mitochondries, le noyau et le RE afin de tester la spécificité des organites des protéines détectées, correspondant à une précision de 73,4, 78,5 et 73,0% (Fig. 3e).La spécificité de PDPL confirme que PDPL est un outil idéal pour identifier les protéomes spécifiques aux organites.Notamment, l'analyse subochondriale des protéines mitochondriales identifiées a montré que le protéome piégé était principalement distribué dans la matrice et la membrane interne (226 et 106, respectivement), représentant 91,7 % (362) du nombre total de protéines mitochondriales identifiées.un niveau élevé de PDPL a également été confirmé (Fig. 7a supplémentaire).De même, l'analyse sous-nucléaire a montré que le protéome capturé était principalement distribué dans le noyau, le nucléoplasme et le nucléole (Fig. 7b supplémentaire).L'analyse protéomique nucléaire avec un peptide signal de localisation nucléaire (3xNLS) a montré une précision similaire à la construction H2B (Fig. 7c – h supplémentaire).Pour déterminer la spécificité du marqueur PDPL, la laminine nucléaire A a été choisie comme piège POI7 plus discrètement localisé.PDPL a identifié 36 protéines significativement enrichies, dont 12 protéines (30,0 % incluant la lamine A) étaient des protéines bien caractérisées interagissant avec la lamine A annotées par la base de données String, avec un pourcentage plus élevé que la méthode BioID (122 protéines) 28 sur 28. , 22,9 %) 7. Notre méthode a identifié moins de protéines, peut-être en raison de zones d'étiquetage limitées, ce qui a été rendu possible par plus d'oxygène singulet actif.L'analyse GO a montré que les protéines identifiées étaient principalement situées dans le nucléoplasme (26), la membrane nucléaire (10), la membrane nucléaire (9) et les pores nucléaires (5).Collectivement, ces protéines localisées au noyau représentaient 80% des protéines enrichies, démontrant davantage la spécificité de PDPL (Fig. Supplémentaire 8a – d).
Après avoir établi la capacité de PDPL à effectuer un marquage de proximité dans les organites, nous avons ensuite testé si PDPL pouvait être utilisé pour analyser les partenaires de liaison POI.En particulier, nous avons cherché à définir l'analyse PDPL des protéines cytosoliques, qui sont considérées comme des cibles plus difficiles que leurs homologues localisées sur la membrane en raison de leur nature hautement dynamique.La protéine bromodomaine et extraterminale (BET) BRD4 a attiré notre attention pour son rôle clé dans diverses maladies 35, 36 .Le complexe formé par BRD4 est un coactivateur transcriptionnel et une cible thérapeutique importante.En régulant l'expression des facteurs de transcription c-myc et Wnt5a, BRD4 est considéré comme un déterminant clé de la leucémie myéloïde aiguë (LMA), du myélome multiple, du lymphome de Burkitt, du cancer du côlon et des maladies inflammatoires37,38.De plus, certains virus ciblent BRD4 pour réguler la transcription virale et cellulaire, comme le papillomavirus, le VIH et le SARS-CoV-236,39.
Pour cartographier l'interaction BRD4 à l'aide de PDPL, nous avons combiné miniSOG avec une courte isoforme N- ou C-terminale de BRD4.Les résultats protéomiques ont révélé un degré élevé de chevauchement entre les deux constructions (Fig. 9a supplémentaire).Le protéome nucléaire identifié avec miniSOG-H2B couvre 77,6% des protéines interagissant avec BRD4 (Fig. 9b supplémentaire).Ensuite, différents temps d'éclairage (2, 5, 10, 20 min) ont été utilisés pour ajuster le rayon du marqueur (Fig. 4a et données supplémentaires 3).Nous concluons qu'à des photopériodes plus courtes, PDPL marquera principalement des partenaires de liaison directs, tandis que des périodes plus longues incluront des protéines identifiées pendant des périodes de photoactivation plus courtes ainsi que des cibles indirectes dans des complexes de marquage.En fait, nous avons trouvé un fort chevauchement entre les points de temps adjacents (84,6 % pour 2 et 5 min ; 87,7 % pour 5 et 10 min ; 98,7 % pour 10 et 20 min) (Fig. 4b et Supplémentaire Fig. 9c).Dans tous les groupes expérimentaux, nous avons trouvé non seulement l'auto-étiquetage de BRD4, mais plusieurs cibles connues telles que MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A et HMGB1 annotées dans la base de données de chaînes.La force ionique de ces cibles est proportionnelle au temps d'exposition (Fig. 4c et Fig. 9d supplémentaire).L'analyse GO des protéines identifiées dans le groupe de 2 minutes a montré que les protéines identifiées étaient localisées dans le noyau et étaient impliquées dans le remodelage de la chromatine et la fonction de l'ARN polymérase.La fonction moléculaire de la protéine a été enrichie en liaison à la chromatine ou en coactivation transcriptionnelle, conformément à la fonction BRD4 (Fig. 4d).L'analyse des interactions protéiques activée par la base de données de chaînes a révélé un premier niveau d'interactions indirectes entre les complexes d'interaction de la famille BRD4 et HDAC tels que SIN3A, NCOR2, BCOR et SAP130 (Fig. 4e et Fig. 9e supplémentaire), compatible avec les histones acétylées liant BRD4 et HDAC. ..De plus, des cibles représentatives identifiées par LC-MS/MS, notamment Sin3A, NSUN2, Fus et SFPQ, ont été confirmées par Western blot (Fig. 4f).Récemment, il a été rapporté que l'isoforme courte de BRD4 forme des noyaux avec des propriétés de séparation de phase liquide-liquide (LLPS).Les protéines de liaison à l'ARN Fus et SFPQ interviennent dans la LLPS de divers processus cellulaires et ont été identifiées ici comme des protéines de liaison BRD4 non enregistrées.L'interaction entre BRD4 et SFPQ a été confirmée par des expériences de co-immunoprécipitation (co-IP) (figure 4g), suggérant un autre mécanisme de séparation de phases liquide-liquide médiée par BRD4 méritant une enquête plus approfondie.Pris ensemble, ces résultats suggèrent que PDPL est une plate-forme idéale pour identifier les protéines de liaison BRD4 connues ainsi que les protéines de liaison inconnues.
a Représentation schématique du marquage de proximité BRD4 médié par miniSOG, temps d'exposition : 2, 5, 10 et 20 min.b Chevauchement des protéines identifiées à différents temps d'illumination.L'enrichissement en protéines identifié dans HEK293T-miniSOG-BRD4 était statistiquement significatif par rapport au HEK293T de type sauvage.c Intensité ionique lors de la quantification de protéines de liaison BRD4 connues représentatives non marquées pendant la durée d'exposition spécifiée.n = 3 échantillons biologiquement indépendants.Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart type.d Analyse ontologique génique (GO) des protéines identifiées dans le groupe de 2 minutes.Les dix premiers termes GO sont répertoriés.Les bulles sont colorées selon la catégorie de termes GO, et la taille des bulles est proportionnelle au nombre de protéines trouvées dans chaque terme.e Analyse des chaînes de protéines interagissant avec BRD4.Les cercles jaunes sont de la colle directe et les cercles gris sont la première couche de colle indirecte.Les lignes rouges représentent les interactions déterminées expérimentalement et les lignes bleues représentent les interactions prédites.f Les cibles de liaison BRD4 représentatives identifiées en LC-MS/MS ont été vérifiées par Western blot.g Les expériences de co-immunoprécipitation confirment l'interaction entre SFPQ et BRD4.Ces expériences ont été répétées indépendamment au moins deux fois avec des résultats similaires.Les données brutes sont fournies sous forme de fichiers de données brutes.
En plus d'identifier les cibles associées aux POI non enregistrées, nous émettons l'hypothèse que PDPL conviendra à l'identification de substrats pour les enzymes, ce qui nécessiterait la caractérisation de protéines de liaison indirecte dans de grands complexes pour annoter les substrats non enregistrés.La parkine (codée par PARK2) est une ligase E3 et des mutations de la parkine sont connues pour provoquer la maladie de Parkinson juvénile autosomique récessive (AR-JP)42.De plus, la parkine a été décrite comme essentielle pour la mitophagie (autophagie mitochondriale) et l'élimination des espèces réactives de l'oxygène.Cependant, bien que plusieurs substrats de la parkine aient été identifiés, le rôle de la parkine dans cette maladie reste incertain.Pour annoter ses substrats non caractérisés, le PDPL a été testé en ajoutant du miniSOG à l'extrémité N ou C de la parkine.Les cellules ont été traitées avec le transporteur de protons du cyanure de carbonyle m-chlorophénylhydrazone (CCCP) pour activer la parkine via la voie PINK1-Parkin.Par rapport à nos résultats BRD4 PDPL, la fusion de l'extrémité N-terminale de la parkine a révélé un plus grand ensemble de protéines cibles, bien qu'elle couvrait une plus grande partie de l'extrémité C-terminale (177 sur 210) (Figure 5a, b et données supplémentaires 4).le résultat est cohérent avec les rapports selon lesquels les étiquettes N-terminales peuvent activer de manière aberrante Parkin44.Étonnamment, il n'y avait que 18 protéines qui se chevauchaient dans nos données avec les résultats AP-MS publiés pour Parkin43, probablement en raison de différences entre les lignées cellulaires et les flux de travail protéomiques.En plus de quatre protéines connues (ARDM1, HSPA8, PSMD14 et PSMC3) identifiées par deux méthodes (Fig. 5c)43.Pour valider davantage les résultats de LC-MS/MS, le traitement PDPL et le Western blot ultérieur ont été utilisés pour comparer les résultats du test de cellule mère HEK293T et de la lignée parkin N-terminale stable.Des cibles auparavant inconnues CDK2, DUT, CTBP1 et PSMC4 ont été testées avec un liant connu, DNAJB1 (Fig. 5d).
Parcelle volcanique des protéines interagissant avec la parkine dans les cellules HEK293T avec un miniSOG exprimé de manière stable fusionné à l'extrémité N- ou C-terminale de la parkine (n = 3 expériences biologiques indépendantes).Le test t de Student bilatéral a été utilisé sur les parcelles de volcan.HEK293T a été utilisé comme contrôle négatif. Les protéines significativement modifiées sont surlignées en rouge (p < 0,05 et > 2 fois la différence d'intensité des ions). Les protéines significativement modifiées sont surlignées en rouge (p < 0,05 et > 2 fois la différence d'intensité des ions). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсив ). Les protéines significativement modifiées sont surlignées en rouge (p < 0,05 et > 2 fois la différence d'intensité ionique).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной сионной сионной сионной). Les protéines significativement altérées sont surlignées en rouge (p < 0,05 et > 2 fois la différence de force ionique).Les protéines apparentées importantes pour HEK293T-miniSOG mais non importantes pour HEK293T sont indiquées en vert.b Diagramme de Venn montrant des protéines qui se chevauchent entre les constructions N-terminales et C-terminales.Les étiquettes N-terminales peuvent activer de manière aberrante la parkine et entraîner des protéines plus reconnaissables.c Diagramme de Venn montrant des protéines qui se chevauchent entre PDPL et AP-MS.Les interacteurs connus sont répertoriés, y compris 4 des 18 protéines qui se chevauchent et 11 des 159 protéines spécifiquement identifiées dans PDPL.d Les cibles représentatives identifiées par LC-MS/MS ont été vérifiées par Western blot.e Ssu72 et SNW1 ont été identifiés comme des substrats de parkine non enregistrés.Ces plasmides protéiques marqués FLAG ont été transfectés dans HEK293T et HEK293T-Parkin-miniSOG, suivis d'un traitement CCCP à différents moments.La dégradation était plus prononcée dans la lignée de surexpression de Parkin.f En utilisant l'inhibiteur de protéasome MG132, il a été confirmé que le processus de dégradation de Ssu72 et SNW1 est médié par l'ubiquitination du protéasome.Ces expériences ont été répétées indépendamment au moins deux fois avec des résultats similaires.Les données brutes sont fournies sous forme de fichiers de données brutes.
Notamment, les protéines identifiées par PDPL doivent inclure des protéines de liaison à la parkine et leurs substrats.Pour détecter les substrats de parkine non enregistrés, nous avons sélectionné sept protéines identifiées (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 et SNW1) et des plasmides transfectés pour exposer ces gènes à HEK293T normal et exprimer de manière stable le HEK293T de miniSOG-Parkin suivi d'un traitement CCCP.Les niveaux de protéines Ssu72 et SNW1 ont été significativement réduits dans la lignée miniSOG-Parkin stable (Fig. 5e).Le traitement avec CCCP pendant 12 heures a entraîné la dégradation la plus significative des deux substrats.Pour déterminer si la dégradation de Ssu72 et de SNW1 est régulée par l'ubiquitination du protéasome, l'inhibiteur de protéasome MG132 a été ajouté pour inhiber l'activité du protéasome et, en fait, nous avons constaté que leur processus de dégradation était inhibé (Fig. 5f).Des cibles supplémentaires sans substrat ont été confirmées en tant qu'interacteurs de Parkin à l'aide du transfert Western (Fig. 10 supplémentaire), qui ont montré des résultats cohérents avec LC-MS/MS.En conclusion, l'intégration du flux de travail PDPL avec la vérification de la transfection de la protéine cible permet l'identification de substrats de ligase E3 non enregistrés.
Nous avons développé une plateforme commune de marquage de proximité qui permet d'identifier dans l'espace et dans le temps les POI en interaction.La plate-forme est basée sur la protéine photosensibilisante miniSOG, qui ne fait qu'environ 12 kDa, soit moins de la moitié de la taille de l'enzyme mature APEX2 (27 kDa) et un tiers de la taille de TurboID (35 kDa).La plus petite taille devrait considérablement élargir la gamme d'applications pour l'étude des interactions de petites protéines.Une exploration plus approfondie de photosensibilisateurs supplémentaires, qu'il s'agisse de protéines codées génétiquement ou de petites molécules, est nécessaire pour augmenter le rendement quantique de l'oxygène singulet et élargir la sensibilité de cette approche.Pour la version actuelle de miniSOG, une résolution temporelle élevée peut être obtenue en utilisant un éclairage bleu pour activer les marqueurs de proximité.En outre, un temps d'exposition plus long a libéré un «nuage» plus important d'oxygène singulet, entraînant une modification des résidus d'histidine plus distaux, un rayon d'étiquetage accru et la possibilité d'affiner la résolution spatiale du PDPL.Nous avons également testé sept sondes chimiques pour augmenter le rapport signal sur fond et exploré le mécanisme moléculaire derrière cette approche.Le flux de travail TOP-ABPP combiné à une recherche ouverte impartiale a confirmé que les modifications ne se produisaient que dans les histidines et qu'aucun microenvironnement cohérent n'a été observé pour une augmentation des modifications de l'histidine, à l'exception d'une préférence modérée pour les histidines dans la région de la boucle.
Le PDPL a également été utilisé pour caractériser les protéomes subcellulaires avec une spécificité et une couverture des protéomes au moins comparables à d'autres méthodes de marquage de proximité et de sondes chimiques spécifiques aux organites.Les marqueurs de proximité ont également été utilisés avec succès pour caractériser les protéomes de surface, lysosomiques et associés au sécrétome46,47.Nous pensons que PDPL sera compatible avec ces organites subcellulaires.De plus, nous avons défié PDPL en identifiant des cibles pour la liaison aux protéines cytosoliques qui sont plus complexes que les protéines liées à la membrane en raison de leurs propriétés dynamiques et de leur implication dans des interactions plus temporelles.PDPL a été appliqué à deux protéines, le coactivateur transcriptionnel BRD4 et la ligase associée à la maladie E3 Parkin.Ces deux protéines ont été choisies non seulement pour leurs fonctions biologiques fondamentales, mais aussi pour leur pertinence clinique et leur potentiel thérapeutique.Pour ces deux POI, des partenaires de liaison bien connus ainsi que des cibles non enregistrées ont été identifiés.Notamment, la protéine SFPQ associée à la séparation de phase a été confirmée par co-IP, ce qui peut indiquer un nouveau mécanisme par lequel BRD4 (isoforme courte) régule LLPS.Dans le même temps, nous pensons que l'identification des substrats Parkin est un scénario dans lequel l'identification des adhésifs indirects est nécessaire.Nous avons identifié deux substrats de parkine non identifiés et confirmé leur dégradation le long de la voie ubiquitination-protéasome.Récemment, une stratégie de piégeage basée sur un mécanisme a été développée pour détecter les substrats d'hydrolase en les piégeant avec des enzymes.Bien qu'il s'agisse d'une méthode très puissante, elle n'est pas adaptée à l'analyse de substrats impliqués dans la formation de grands complexes et nécessite la formation de liaisons covalentes entre l'enzyme et le substrat.Nous nous attendons à ce que PDPL puisse être étendu pour étudier d'autres complexes protéiques et familles d'enzymes, telles que les familles des déubiquitinases et des métalloprotéases.
Une nouvelle forme de miniSOG, appelée SOPP3, a été développée avec une meilleure production d'oxygène singulet.Nous avons comparé miniSOG avec SOPP3 et constaté une amélioration des performances de marquage, bien que le rapport signal sur bruit soit resté inchangé (Fig. 11 supplémentaire).Nous avons émis l'hypothèse que l'optimisation de SOPP3 (par exemple, par évolution dirigée) conduirait à des protéines photosensibilisantes plus efficaces qui nécessitent des temps d'éclairage plus courts et permettent ainsi de capturer des processus cellulaires plus dynamiques.Notamment, la version actuelle de PDPL est limitée à l'environnement cellulaire car elle nécessite un éclairage à la lumière bleue et ne peut pas pénétrer les tissus profonds.Cette caractéristique exclut son utilisation dans des études sur des modèles animaux.Cependant, la combinaison de l'optogénétique avec PDPL pourrait offrir une opportunité pour la recherche animale, en particulier dans le cerveau.De plus, d'autres photosensibilisateurs infrarouges techniques suppriment également cette limitation.Des recherches sont actuellement en cours dans ce domaine.
La lignée cellulaire HEK293T a été obtenue auprès de l'ATCC (CRL-3216).La lignée cellulaire a été testée négative pour l'infection par les mycoplasmes et a été cultivée dans du DMEM (Thermo, #C11995500BT) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (FBS, Vistech, #SE100-B) et de 1 % de pénicilline/streptomycine (Hyclone, #SV30010).Cultivé en.
Le 3-aminophénylène (échantillon 3) et la (4-éthynylphényl)méthanamine (échantillon 4) ont été achetés chez Bidepharm.La propylamine (sonde 2) a été achetée chez Energy-chemicals.Le N-(2-aminophényl)pent-4-ynamide (sonde 1) a été synthétisé selon des méthodes publiées.
Le tableau supplémentaire 1 répertorie les constructions génétiques utilisées dans cette étude.Les séquences miniSOG et KillerRed ont été clonées à partir d'un plasmide cadeau de P. Zou (Peking University).La séquence de ciblage de la matrice mitochondriale a été dérivée des 23 acides aminés N-terminaux de COX4 et clonée dans les vecteurs indiqués à l'aide d'un assemblage Gibson (Beyotime, #D7010S).Pour cibler la membrane et le noyau du réticulum endoplasmique, ADN humain SEC61B (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) amplifié par PCR à partir d'une banque d'ADNc de cellules HEK293T, et ADN H2B (don de D. Lin, Laboratoire de la Baie de Shenzhen) et cloné, comme mentionné ci-dessus.Sauf indication contraire, d'autres gènes de protéines utilisés pour la transfection et la construction de lignées cellulaires stables ont été amplifiés par PCR à partir de la bibliothèque d'ADNc de cellules HEK293T.G3S (GGGS) et G4S (GGGGS) ont été utilisés comme lieurs entre la protéine appât et miniSOG.Une étiquette d'épitope V5 (GKPIPNPLLGLDST) a été ajoutée à ces constructions de fusion.Pour l'expression chez les mammifères et pour établir une lignée cellulaire stable, la construction de fusion miniSOG a été sous-clonée dans le vecteur lentiviral pLX304.Pour l'expression bactérienne, miniSOG a été cloné dans le vecteur pET21a marqué 6xHis à l'extrémité C-terminale.
Les cellules HEK293T ont été ensemencées à 2,0 x 105 cellules par puits dans des plaques à six puits et transfectées 24 heures plus tard avec des plasmides lentiviraux recombinants (2,4 μg pLX304) et des plasmides d'encapsidation virale (1,5 μg psPAX2 et 1,2 μg pMD2.G) en utilisant Lipo8000 (Beyotime , #C0533), environ 80 % de fusion.Après une nuit de transfection, le milieu a été changé et incubé pendant 24 heures supplémentaires.La collecte du virus a été réalisée après 24, 48 et 72 heures.Avant l'infection des lignées cellulaires cibles, le milieu viral a été filtré à travers un filtre de 0,8 µm (Merck, #millex-GP) et du polybrène (Solarbio, #H8761) a été ajouté à une concentration de 8 µg/ml.Après 24 heures, les cellules ont été laissées récupérer en changeant le milieu.Les cellules ont été sélectionnées en utilisant 5 μg/ml de blasticidine (Solarbio, #3513-03-9) pour les trois premiers passages en tant que sélection moins stricte.Puis utilisé 20 μg/ml comme régime plus strict pour les trois passages suivants.
Les cellules ont été ensemencées dans des chambres à 12 puits (Ibidi, #81201) à une densité d'environ 20 000 cellules par puits.Pour améliorer l'adhérence des cellules HEK293T, ajouter 50 µg/ml de fibronectine (Corning, #356008) diluée dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, Sangon, #B640435) à 37°C.Les chambres ont été prétraitées pendant 1 heure puis retirées avec du PBS.Après 24 h, les cellules ont été lavées une fois avec du PBS, incubées avec la sonde 3 1 mM dans une solution saline équilibrée de Hanks fraîche (HBSS, Gibco, #14025092) pendant 1 h à 37°C, puis incubées avec une LED bleue (460 nm ).) ont été irradiés pendant 10 min à température ambiante.Après cela, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS et fixées avec du formaldéhyde à 4 % dans du PBS (Sangon, #E672002) pendant 15 minutes à température ambiante.Le formaldéhyde en excès a été éliminé des cellules fixées en lavant trois fois avec du PBS.Les cellules ont ensuite été perméabilisées avec du Triton X-100 à 0,5 % (Sangon, #A600198) dans du PBS et lavées 3 fois avec du PBS.Retirez ensuite la chambre et ajoutez à chaque échantillon 25 µl d'un mélange de réaction click contenant 50 µM Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) et 0,5 mg/ml d'ascorbate de sodium (Aladdin, n° S105024) et incubé pendant 30 minutes à température ambiante.Après une réaction rapide, les cellules ont été lavées six fois avec du PBS contenant 0,05% de Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) puis bloquées avec 5% de BSA (Abcone, #B24726) dans du PBST pendant 30 minutes à température ambiante.
Pour l'immunocoloration de colocalisation, les cellules ont été incubées avec des anticorps primaires selon les conditions indiquées : mAb anti-étiquette V5 de souris (1:500, CST, #80076), mAb anti-Hsp60 de lapin (1:1000), ABclonal, #A0564), anticorps polyclonal anti-calnexine de lapin (1:500, Abcam, #ab22595) ou anticorps monoclonal anti-lamine A/C de lapin (1:500; CST, #2032) à 4 °C pendant la nuit.Après 3 lavages au PBST, les cellules ont été incubées avec des anticorps secondaires : chèvre anti-lapin Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) dilué au 1:1000, chèvre anti-souris Alexa Fluor 594 (CST, #8889) dilué au 1:1000.dilution Diluer à température ambiante pendant 30 minutes.Les cellules ont ensuite été lavées 3 fois avec du PBST et contre-colorées avec du DAPI (Thermo, #D1306) dans du PBS pendant 10 minutes à température ambiante.Après 3 lavages avec du PBS, les cellules ont été scellées dans du glycérol à 50 % (Sangon, #A600232) dans du PBS pour l'imagerie.Les images immunofluorescentes ont été obtenues à l'aide d'un microscope confocal ZEISS LSM 900 Airyscan2 et du logiciel ZNE 3.5.
Pour l'imagerie fluorescente à oxygène singulet, les cellules ont été lavées deux fois avec un tampon Hanks HEPES avant d'ajouter 100 nM de Si-DMA dans un tampon Hanks HEPES (DOJINDO, #MT05).Après exposition à la lumière, les cellules ont été incubées dans un incubateur à CO2 à 37°C pendant 45 minutes.Les cellules ont ensuite été lavées deux fois avec du tampon HEPES de Hanks et contre-colorées avec Hoechst dans du tampon HEPES de Hanks pendant 10 minutes à température ambiante et visualisées à l'aide d'un microscope confocal ZEISS LSM 900., #M36008) dans un tampon HBSS contenant du calcium et du magnésium.Après exposition à la lumière ou à la doxorubicine (MCE, #HY-15142A), les cellules ont été incubées dans un incubateur à CO2 à 37°C pendant 10 minutes, lavées deux fois avec du tampon HBSS et incubées avec Hoechst dans du tampon HBSS à température ambiante.minutes.La doxorubicine a été utilisée comme témoin de sonde positif où les cellules ont été traitées avec de la doxorubicine 20 μM dans du HBSS contenant 1 % de BSA pendant 30 min.Les images immunofluorescentes ont été obtenues à l'aide d'un microscope confocal Zeiss LSM 900.
Des cellules HEK293T exprimant de manière stable mito-miniSOG ont été ensemencées à une densité d'environ 30 % dans des boîtes de 15 cm.Après 48 heures, lorsque la confluence d'environ 80 % a été atteinte, les cellules ont été lavées une fois avec du PBS, incubées avec 1 mM de sonde 3 dans du tampon HBSS frais pendant 1 heure à 37 °C, puis illuminées avec une LED bleue pendant 10 minutes à température ambiante. Température..Ensuite, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS, grattées et remises en suspension dans un tampon PBS glacé contenant des inhibiteurs de protéase sans EDTA (MCE, #HY-K0011).Les cellules ont été lysées par sonication de la pointe pendant 1 minute (1 seconde allumée et 1 seconde éteinte à 35 % d'amplitude).Le mélange résultant a été centrifugé à 15 871 xg pendant 10 min à 4 °C pour éliminer les débris, et la concentration du surnageant a été ajustée à 4 mg/mL à l'aide d'un kit d'analyse de protéines BCA (Beyotime, #P0009).Combiner 1 ml du lysat ci-dessus avec de l'azoture de biotine photodégradable 0,1 mM (Confluore, #BBBD-14), TCEP 1 mM (Sangon, #A600974), ligand TBTA 0,1 mM (Aladdin, #T162437) et incubateur CuSO4 1 mM avec fond rotation pendant 1 heure à température ambiante.Après une réaction rapide, ajouter le mélange à la solution prémélangée (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) dans un flacon en verre de 10 ml.Les échantillons ont été mélangés et centrifugés à 4500 g pendant 10 minutes à température ambiante.Les solutions inférieure et supérieure ont été jetées, le précipité a été lavé deux fois avec 1 ml de méthanol et centrifugé à 15871 xg pendant 5 min à 4°C.Ajouter 1 ml d'urée 8 M (Aladdin, n° U111902) dans du bicarbonate d'ammonium 25 mM (ABC, Aladdin, n° A110539) pour dissoudre le précipité.Les échantillons ont été reconstitués avec du dithiothréitol 10 mM (Sangon, # A100281 dans ABC 25 mM) pendant 40 minutes à 55 ° C, suivi de l'ajout de iodoacétamide frais 15 mM (Sangon, # A600539) à température ambiante dans l'obscurité.Alkylation en 30 minutes..Un dithiothréitol 5 mM supplémentaire a été ajouté pour arrêter la réaction.Préparer environ 100 µl de billes d'agarose NeutrAvidin (Thermo, #29202) pour chaque échantillon en lavant 3 fois avec 1 ml de PBS.La solution de protéome ci-dessus a été diluée avec 5 ml de PBS et incubée avec des billes d'agarose NeutrAvidin prélavées pendant 4 heures à température ambiante.Les billes ont ensuite été lavées 3 fois avec 5 ml de PBS contenant 0,2 % de SDS (Sangon, #A600485), 3 fois avec 5 ml de PBS contenant 1 M d'urée et 3 fois avec 5 ml de ddH2O.Les billes ont ensuite été récoltées par centrifugation et remises en suspension dans 200 μl d'ABC 25 mM contenant 1 M d'urée, 1 mM de CaCl 2 (Macklin, #C805228) et 20 ng/μl de trypsine (Promega, #V5280).Trypsiniser une nuit à 37°C avec rotation.La réaction a été arrêtée en ajoutant de l'acide formique (Thermo, # A117-50) jusqu'à ce que le pH atteigne 2-3.Les billes ont été lavées 3 fois avec 1 ml de PBS contenant 0,2% de SDS, 3 fois avec 1 ml de PBS contenant 1 M d'urée, puis 3 fois avec 1 ml d'eau distillée.Les peptides modifiés ont été libérés par lyse légère (365 nm) pendant 90 min en utilisant 200 µl de MeOH à 70 %.Après centrifugation, le surnageant a été récupéré.Les billes ont ensuite été lavées une fois avec 100 μl de MeOH à 70% et les surnageants ont été regroupés.Les échantillons ont été séchés dans un concentrateur sous vide Speedvac et stockés à -20°C jusqu'à l'analyse.
Pour identifier et quantifier les peptides modifiés à l'oxygène singulet, les échantillons ont été redissous dans de l'acide formique à 0, 1% et 1 μg de peptides ont été analysés à l'aide d'un spectromètre de masse Orbitrap Fusion Lumos Tribrid équipé d'une source nano ESI de Tune et Xcalibur du logiciel fournisseur 4.3.Les échantillons ont été séparés sur une colonne capillaire à garnissage interne de 75 µm × 15 cm avec un matériau C18 de 3 µm (ReproSil-pur, #r13.b9.) et connectée à un système UHPLC EASY-nLC 1200 (Thermo).Les peptides ont été séparés par chromatographie en gradient linéaire de 95 minutes de 8% de solvant B à 50% de solvant B (A = 0,1% d'acide formique dans l'eau, B = 0,1% d'acide formique dans 80% d'acétonitrile), puis augmentés linéairement à 98% B min en 6 min à un débit de 300 nl/min.Orbitrap Fusion Lumos collecte les données alternativement entre l'analyse MS complète et l'analyse MS2 en fonction des données.La tension de pulvérisation a été fixée à 2,1 kV et la température du capillaire de transport d'ions était de 320°C.Les spectres MS (350-2000 m/z) ont été collectés avec une résolution de 120 000, AGC 4 × 105 et un temps d'entrée maximum de 150 ms.Les 10 précurseurs multichargés les plus courants dans chaque analyse complète ont été fragmentés à l'aide de HCD avec une énergie de collision normalisée de 30 %, une fenêtre d'isolement quadripolaire de 1,6 m/z et un réglage de résolution de 30 000.Une cible AGC pour la spectrométrie de masse en tandem utilisant 5 × 104 et un temps d'entrée maximal de 150 ms.L'exception dynamique est définie sur 30 secondes. Les ions non attribués ou ceux avec une charge de 1+ et >7+ ont été rejetés pour MS/MS. Les ions non attribués ou ceux avec une charge de 1+ et >7+ ont été rejetés pour MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ et >7+ были отклонены для МС/МС. Les ions non attribués ou les ions avec une charge de 1+ et >7+ ont été rejetés pour MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ et >7+ были отклонены для МС/МС. Les ions non spécifiés ou les ions avec des charges de 1+ et >7+ ont été rejetés pour MS/MS.
Les données brutes sont traitées à l'aide de la plate-forme informatique FragPipe basée sur MSFragger.Les biais de masse et les acides aminés correspondants ont été déterminés à l'aide d'un algorithme de recherche ouvert avec une tolérance de masse des précurseurs de -150 à 500 Da.Les peptides modifiés ont ensuite été identifiés à l'aide de modifications d'histidine avec des gains de masse de +229,0964 et +247,1069 Da en PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Les cellules exprimant de manière stable le gène miniSOG fusionné ont été étalées dans des boîtes de 6 cm.Après avoir atteint une confluence d'environ 80 %, les cellules ont été lavées une fois avec du HBSS (Gibco, #14025092), puis incubées avec des sondes chimiques dans du HBSS pendant 1 heure à 37 °C et illuminées avec de la lumière bleue.LED 10W pendant 20 minutes à température ambiante.Pour déterminer quel type d'espèce réactive de l'oxygène est impliqué dans le PDPL, 0,5 mM de vitamine C (MCE, #HY-B0166), 5 mM de Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), 100 mM de mannitol (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM de H2O2, 10 mM de NaN3 ont été ajoutés aux cellules comme suppléments.Après lavage avec du PBS froid, les cellules ont été grattées, collectées dans des tubes à centrifuger de 1,5 ml et soniquées avec une pointe pendant 1 min dans 200 μl de PBS avec 1x inhibiteur de protéase sans EDTA (1 s et 1 s sans, amplitude 35%).Le mélange résultant a été centrifugé à 15 871 × g pendant 10 min à 4 ° C et la concentration du surnageant a été ajustée à 1 mg/mL à l'aide d'un kit de dosage de protéines BCA.Environ 50 µl du lysat ci-dessus ont été incubés avec de l'azide de rhodamine 0,1 mM (Aladdin, n° T131368), TCEP 1 mM, ligand TBTA 0,1 mM et CuSO4 1 mM pendant 1 heure à température ambiante avec rotation de bas en haut.Après la réaction de clic, une précipitation avec de l'acétone a été effectuée en ajoutant 250 μl d'acétone pré-réfrigérée aux échantillons, en incubant à -20°C pendant 20 min et en centrifugeant à 6010 xg pendant 10 min à 4°C.Recueillir le culot et faire bouillir dans 50 pi de tampon de 1x Laemmli pendant 10 min à 95 ° C.Les échantillons ont ensuite été analysés sur des gels longs SDS-PAGE et visualisés à l'aide du système d'imagerie Bio-rad ChemiDoc MP Touch avec le logiciel Image Lab Touch.
L'expression et la purification de la protéine recombinante miniSOG-6xHis ont été réalisées comme décrit précédemment.En bref, des cellules E. coli BL21 (DE3) (TransGen, # CD701-02) ont été transformées avec pET21a-miniSOG-6xHis et l'expression de la protéine a été induite avec 0, 5 mM d'IPTG (Sangon, # A600168).Après la lyse cellulaire, les protéines ont été purifiées à l'aide de billes d'agarose Ni-NTA (MCE, n° 70666), dialysées contre du PBS et stockées à -80°C.
Pour un test de proximité d'étiquette in vitro à base d'anticorps, mélanger 100 μM de miniSOG purifié, 1 mM de sonde 3 et 1 μg d'anticorps monoclonal de souris anti-étiquette (TransGen, # HT501-01) dans du PBS pour un volume de réaction total de 50 μl..Le mélange réactionnel a été irradié avec une lumière LED bleue pendant 0, 2, 5, 10 et 20 min à température ambiante.Le mélange a été incubé avec 0, 1 mM de biotine-PEG3-azide (Aladdin, # B122225), 1 mM de TCEP, 0, 1 mM de ligand TBTA et 1 mM de CuSO4 pendant 1 h à température ambiante sur un agitateur à mouvement ascendant.Après une réaction instantanée, ajouter le tampon de 4x Laemmli directement au mélange et faire bouillir à 95°C pendant 10 min.Les échantillons ont été analysés sur des gels SDS-PAGE et analysés par Western blot avec de la streptavidine-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).
Un peptide synthétique contenant de l'histidine avec amidation C-terminale (LHDALDAK-CONH2) a été utilisé pour analyser le marquage in vitro à base de peptides à proximité.Dans cet essai, 100 μM de miniSOG purifié, 10 mM de sonde 3 et 2 μg/ml de peptide synthétique ont été mélangés dans du PBS dans un volume réactionnel total de 50 μl.Le mélange réactionnel a été irradié avec une lumière LED bleue pendant 1 heure à température ambiante.Un microlitre d'échantillon a été analysé à l'aide d'un système LC-MS (Waters, spectromètre de masse SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight avec logiciel d'analyse de spectre MassLynx).
Des cellules HEK293T exprimant de manière stable le gène de fusion miniSOG ont été ensemencées dans des boîtes de 10 cm pour les lignées avec différentes localisations d'organelles (Mito, ER, Nucleus) et des boîtes de 15 cm pour les lignées Parkin-miniSOG et BRD4-miniSOG.Après avoir atteint ~ 90 % de confluence, les cellules ont été lavées une fois avec du HBSS, puis incubées avec la sonde 3 dans du HBSS pendant 1 heure à 37 °C et illuminées avec une LED bleue de 10 W à température ambiante.Pour le marquage sans contact de Parkin, 10 µM de support de cyanure de proton carbonyle m-chlorophénylhydrazone CCCP (Solarbio, #C6700) avec la sonde 3 dans du HBSS ont été ajoutés pendant 1 heure à 37 °C.Les étapes de lyse cellulaire, de chimie du clic, de réduction et d'alkylation étaient les mêmes que celles décrites ci-dessus, sauf que 2 mg de lysat ont été ajoutés et que l'azide de biotine PEG3 a été utilisé dans la réaction de clic au lieu de l'azide de biotine photodégradable.Après enrichissement, les billes ont été lavées 3 fois avec 5 ml de PBS contenant 0,2 % de SDS, 3 fois avec 5 ml de PBS contenant 1 M d'urée et 3 fois avec 5 ml de PBS.Ensuite, 2 ug de trypsine ont été ajoutés à 300 ul d'ABC 25 mM contenant 1 M d'urée pour cliver la protéine pendant une nuit à 37°C.La réaction a été arrêtée en ajoutant de l'acide formique jusqu'à ce qu'un pH de 2-3 soit atteint.Après trypsination sur billes, la solution de peptide a été dessalée à l'aide d'une colonne SOLAµ HRP (Thermo, #60209-001) et séchée dans un concentrateur sous vide Speedvac.Les peptides ont été redissous dans de l'acide formique à 0,1 % et 500 ng de peptides ont été analysés à l'aide d'un spectromètre de masse Orbitrap Fusion Lumos Tribrid équipé de la source nano-ESI décrite ci-dessus.Les peptides ont été séparés sur des précolonnes RP-HPLC commerciales (75 μm x 2 cm) (Thermo, n° 164946) et des colonnes RP-HPLC analytiques (75 μm x 25 cm) (Thermo, n° 164941), toutes deux remplies de 2 μm.gradient de 8 % à 35 % d'ACN en 60 minutes, puis augmenté linéairement jusqu'à 98 % de B en 6 minutes à un débit de 300 Nl/min.Les spectres MS (350-1500 m/z) ont été collectés avec une résolution de 60 000, AGC 4 × 105 et un temps d'entrée maximum de 50 ms.Les ions sélectionnés ont été fragmentés séquentiellement par HCD en cycles de 3 s avec une énergie de collision normalisée de 30 %, une fenêtre d'isolement quadripolaire de 1,6 m/z et une résolution de 15 000. Une cible AGC de spectromètre de masse en tandem 5 × 104 et un temps d'injection maximal de 22 ms ont été utilisés.L'exclusion dynamique est fixée à 45 secondes. Les ions non attribués ou ceux avec une charge de 1+ et >7+ ont été rejetés pour MS/MS. Les ions non attribués ou ceux avec une charge de 1+ et >7+ ont été rejetés pour MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ et >7+ были отклонены для МС/МС. Les ions non attribués ou les ions avec une charge de 1+ et >7+ ont été rejetés pour MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ et >7+ были отклонены для МС/МС. Les ions non spécifiés ou les ions avec des charges de 1+ et >7+ ont été rejetés pour MS/MS.
Les étapes de préparation de l'échantillon jusqu'à l'enrichissement des billes NeutrAvidin étaient les mêmes que dans l'analyse LC-MS/MS décrite ci-dessus.Environ 50 μg de lysat ont été utilisés comme entrée pour le contrôle de chargement et 2 mg de lysat ont été utilisés pour les réactions de clic.Après enrichissement et lavage à la neutravidine, les protéines liées ont été éluées en ajoutant 50 µl de tampon de Laemmli aux billes de résine d'agarose et en faisant bouillir à 95°C pendant 5 minutes.L'entrée de charge de contrôle et les échantillons enrichis en billes ont été analysés par SDS-PAGE et transférés sur des membranes PVDF (Millipore, #ISEQ00010) par des méthodes standard de Western blot.Les membranes ont été bloquées avec du lait écrémé à 5 % (Sangon, #A600669) dans du TBS contenant 0,1 % de tween-20 (TBST) et incubées séquentiellement avec des anticorps primaires et secondaires.Les anticorps primaires ont été dilués au 1:1000 dans du lait écrémé à 5 % dans du TBST et incubés pendant une nuit à 4°C.Les anticorps secondaires ont été utilisés dans un rapport de 1:5000 et incubés pendant 1 heure à température ambiante.Les membranes ont été visualisées par chimiluminescence à l'aide du système d'imagerie Chemidoc MP.Tous les scans non coupés de transferts et de gels de la figure sont présentés sous forme de données brutes.
Les anticorps primaires utilisés dans cette étude comprenaient l'anticorps monoclonal de lapin anti-SFPQ (CST, n° 71992), l'anticorps monoclonal de lapin anti-FUS (CST, n° 67840), l'anticorps polyclonal de lapin anti-NSUN2 (Proteintech, n° 20854-1- AP), anticorps polyclonal de lapin anti-mSin3A (Abcam, #ab3479), anticorps monoclonal anti-tag de souris (TransGen, #HT201-02), anticorps monoclonal de souris anti-β-actine (TransGen, #HC201-01), anti- -Anticorps monoclonal CDK2 (ABclonal, #A0094), anticorps monoclonal de lapin anti-CTBP1 (ABclonal, #A11600), anticorps polyclonal de lapin anti-DUT (ABclonal, #A2901), anticorps polyclonal de lapin anti-PSMC4 (ABclonal, #A2505), anti- Anticorps polyclonal DNAJB1 (ABclonal, # A5504).Ces anticorps ont été utilisés à une dilution de 1:1000 dans du lait écrémé à 5 % dans du TBST.Les anticorps secondaires utilisés dans cette étude comprenaient des IgG anti-lapin (TransGen, #HS101-01), des IgG anti-souris (TransGen, #HS201-01) à une dilution de 1:5000.
Pour étudier plus avant si BRD4 interagit avec SFPQ, des cellules stables HEK293T et BRD4-miniSOG surexprimant HEK293T ont été étalées dans des boîtes de 10 cm.Les cellules ont été lavées avec du PBS froid et lysées dans 1 ml de tampon de lyse Pierce IP (Thermo Fisher, #87787) avec un inhibiteur de protéase sans EDTA pendant 30 minutes à 4°C.Après cela, les lysats ont été recueillis dans des tubes à centrifuger de 1,5 ml et centrifugés à 15 871 xg pendant 10 min à 4°C.Le surnageant a été récolté et incubé avec 5 ug d'anticorps monoclonal de souris marqué anti-V5 (CST, #80076) pendant une nuit à 4°C.Laver environ 50 µl de billes magnétiques de protéine A/G (MCE, #HY-K0202) deux fois avec du PBS contenant 0,5 % de Tween-20.Ensuite, les lysats cellulaires ont été incubés avec des billes magnétiques pendant 4 heures à 4°C avec rotation de bas en haut.Ensuite, les billes ont été lavées quatre fois avec 1 ml de tampon PBST et bouillies à 95°C pendant 5 min.Les échantillons ont été analysés sur des gels SDS-PAGE et transférés sur des membranes PVDF en utilisant des méthodes standard de Western blot.Les membranes ont été bloquées dans du lait écrémé à 5 % dans du TBST et incubées séquentiellement avec des anticorps primaires et secondaires.Anticorps primaire Un anticorps monoclonal anti-SFPQ de lapin (CST, #71992) a été utilisé dans un rapport de 1:1000 dans du lait écrémé à 5 % dans du TBST et incubé pendant une nuit à 4°C.L'IgG anti-lapin a été utilisée dans un rapport de 1:5000 et incubée pendant 1 heure à température ambiante.Les membranes ont été visualisées par chimiluminescence à l'aide du système d'imagerie Chemidoc MP.
Toutes les structures utilisées pour l'analyse de la surface accessible au solvant (SASA) ont été obtenues à partir de la Protein Data Bank (PDB)52 ou de la AlphaFold Protein Structure Database53.Le SASA absolu a été calculé pour chaque résidu à l'aide du programme FreeSASA.Seules des données SASA complètes et non ambiguës pour l'histidine marquée et ses voisins ont été utilisées pour obtenir le SASA moyen pour chaque structure.L'accessibilité relative au solvant (RSA) pour chaque histidine a été calculée en divisant la valeur absolue de SASA par la surface de résidu empirique maximale possible disponible pour le solvant.Toutes les histidines étaient alors classées comme cachées si le RSA moyen était inférieur à 20 %, sinon exposées56.
Les fichiers bruts obtenus en mode DDA ont été recherchés à l'aide de Proteome Discoverer (v2.5) ou MSfragger (Fragpipe v15.0) dans la base de données de protéines vérifiée SwissProt appropriée contenant des contaminants courants.Les peptides nécessitaient une trypsine complète avec deux sites de clivage manquants, la méthylation du carbamoyle comme modification fixe et l'oxydation de la méthionine comme modification dynamique.Les tolérances de poids des précurseurs et des fragments ont été fixées à 10 ppm et 0,02 Da (MS2 Orbitrap), respectivement. Les occurrences de contaminants ont été supprimées et les protéines ont été filtrées pour obtenir un taux de fausses découvertes de <1 %. Les occurrences de contaminants ont été supprimées et les protéines ont été filtrées pour obtenir un taux de fausses découvertes de <1 %. ПоvresT ourseния загрязняющих веществ ыли удалены, а белrien оттильттрованы, чтобы поллччч ктрованы. Les touches de contaminants ont été supprimées et les protéines filtrées pour donner un taux de fausse détection de <1 %.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1 %的错误发现率。 Démar Les touches de contaminants ont été supprimées et les protéines filtrées pour obtenir un taux de faux positifs de <1 %.Pour l'analyse quantitative sans l'utilisation de marqueurs, la teneur en protéines normalisée de trois répétitions biologiques a été utilisée.L'analyse de la localisation subcellulaire des protéines a été réalisée à l'aide de l'analyse Gene Ontology (GO) de DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 et des bases de données compilées et publiées par le groupe Alice Ting.La carte du volcan a été obtenue de Perseus (v1.6.15.0). Les changements de pli de l'abondance des protéines ont été testés pour leur signification statistique à l'aide d'un test t bilatéral, et les résultats protéiques ont été identifiés avec un changement d'abondance> 2 (sauf indication contraire) et une valeur p <0, 05. Les changements de pli de l'abondance des protéines ont été testés pour leur signification statistique à l'aide d'un test t bilatéral, et les résultats protéiques ont été identifiés avec un changement d'abondance> 2 (sauf indication contraire) et une valeur p <0, 05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Les changements de pli de contenu en protéines ont été testés pour leur signification statistique à l'aide d'un test t bilatéral, et les correspondances de protéines ont été identifiées avec un changement de contenu> 2 (sauf indication contraire) et une valeur ap <0, 05.使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 丰度 倍数 变化 的 统计 显着性 ， 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 （除非 另 有 说明） 和 P 值 <0,05。使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍 数 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 （另 有 说明） 和 P 值 <0,05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. La signification statistique des changements de pli dans la teneur en protéines a été testée à l'aide d'un test t bilatéral, et les correspondances de protéines ont été déterminées pour les changements de contenu> 2 (sauf indication contraire) et les valeurs de p <0, 05.L'analyse de l'interaction des protéines a été réalisée à l'aide de l'analyse GO avec la base de données String.
Trois répétitions biologiques ont été réalisées avec des résultats similaires.L'analyse statistique a été effectuée avec GraphPad Prism (logiciel GraphPad) et les parcelles de volcan ont été générées avec Perseus (v1.6.15.0).Pour comparer les deux groupes, les valeurs de p ont été déterminées à l'aide d'un test t de Student bilatéral.Seules les protéines singleton identifiées au moins deux fois dans le groupe expérimental ont été incluses dans les parcelles de volcan, et les valeurs manquantes correspondantes dans le groupe témoin ont été remplacées par Perseus à partir d'une distribution normale afin que la valeur p puisse être calculée.Les barres d'erreur représentent la moyenne ± l'écart type.Dans les analyses protéomiques pour l'analyse statistique, l'abondance des protéines qui sont apparues dans au moins deux réplicats biologiques a été conservée.Aucune méthode statistique n'a été utilisée pour prédéterminer la taille de l'échantillon.Les expériences ne sont pas aléatoires.Les chercheurs n'étaient pas aveugles aux tâches pendant l'expérience et l'évaluation des résultats.
Pour plus d'informations sur la conception de l'étude, voir le résumé du rapport de recherche sur la nature lié à cet article.
Les données de spectrométrie de masse obtenues dans cette étude ont été soumises au consortium ProteomeXchange via le référentiel partenaire iProX57 sous l'ID de jeu de données PXD034811 (jeu de données PDPL-MS).Les données brutes sont fournies sous forme de fichiers de données brutes.Cet article fournit les données originales.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Apprendre à connaître le voisinage : utiliser la biotinylation dépendante de la proximité pour caractériser les complexes protéiques et cartographier les organites. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Apprendre à connaître le voisinage : utiliser la biotinylation dépendante de la proximité pour caractériser les complexes protéiques et cartographier les organites.Gingras, AS, Abe, KT et Raut, B. Familiarité avec l'environnement : utilisation de la biotinylation dépendante de la proximité pour caractériser les complexes protéiques et cartographier les organites. Gingras, AC, Abe, KT et Raught, B. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Comprendre le quartier : utiliser la dépendance du quartier à la vie biologique.Gingras, AS, Abe, KT et Raut, B. Comprendre la proximité : caractérisation des complexes protéiques et cartographie des organites à l'aide de la biotinylation dépendante de la proximité.Courant.Mon avis.Chimique.biologie 48, 44–54 (2019).
Geri, JB et al.Cartographier le microenvironnement en transférant l'énergie de Dexter aux cellules immunitaires.Sciences 367, 1091-1097 (2020).
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Heure de publication : 15 septembre 2022
