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Les cellules cancéreuses ont développé divers mécanismes pour surmonter le stress cellulaire et continuer à progresser.La protéine kinase R (PKR) et son activateur protéique (PACT) sont les répondeurs initiaux qui surveillent divers signaux de stress conduisant à l'inhibition de la prolifération cellulaire et de l'apoptose.Cependant, la régulation de la voie PACT-PKR dans les cellules cancéreuses reste largement inconnue.Ici, nous avons constaté que le long ARN non codant (lncRNA) aspartyl ARNt synthétase ARN antisens 1 (DARS-AS1) est directement impliqué dans l'inhibition de la voie PACT-PKR et favorise la prolifération des cellules cancéreuses.À l'aide d'un dépistage fonctionnel à grande échelle de l'ARNlnc associé au cancer CRISPRi 971, nous avons constaté que DARS-AS1 était associé à une prolifération des cellules cancéreuses considérablement améliorée.Par conséquent, le knock-out DARS-AS1 inhibe la prolifération cellulaire et favorise l'apoptose des cellules cancéreuses dans diverses lignées cellulaires cancéreuses in vitro et réduit considérablement la croissance tumorale in vivo.Mécaniquement, DARS-AS1 se lie directement au domaine d'activation PACT et empêche l'interaction PACT-PKR, réduisant ainsi l'activation de PKR, la phosphorylation d'eIF2α et inhibant la mort cellulaire apoptotique.Cliniquement, DARS-AS1 est largement exprimé dans de multiples cancers, et la surexpression de cet ARNlnc est révélatrice d'un mauvais pronostic.Cette étude élucide la régulation spécifique au cancer de la voie PACT-PKR par l'ARNnc DARS-AS1 et fournit une autre cible pour le pronostic et le traitement du cancer.
La capacité d'adaptation au stress est une caractéristique importante de la survie et de la prolifération des cellules cancéreuses.La prolifération rapide et les caractéristiques métaboliques du cancer culminent dans des microenvironnements difficiles - privation de nutriments, hypoxie et pH bas - qui peuvent déclencher des voies de signalisation de la mort cellulaire.La dérégulation des gènes sensibles au stress tels que p535, les protéines de choc thermique 6, 7, KRAS8, 9 et HIF-110, 11, 12, 13 est fréquemment observée dans le cancer, bloquant ainsi l'apoptose et favorisant la survie.
La protéine kinase R (PKR) est un capteur de stress important et une sous-unité kinase du facteur d'initiation eucaryote 2α (eIF2α), un régulateur de traduction qui relie le stress cellulaire à la mort cellulaire.La PKR a été identifiée à l'origine comme une protéine antivirale par la détection d'un ARN double brin étranger (dsRNA).Lors de l'activation, PKR phosphoryle eIF2α pour inhiber la synthèse des protéines virales et cellulaires14,15,16.PACT (protéine activatrice de PKR) a été identifiée comme la première protéine activatrice de PKR en l'absence d'ARNdb17,18,19,20,21,22,23.Grâce à une interaction directe avec PKR, PACT transduit divers stress (privation de sérum, traitement au peroxyde ou à l'arsénite) vers PKR et les voies de signalisation en aval.En plus de la phosphorylation d'eIF2α, l'activation de PKR médiée par PACT déclenche divers événements associés à la réponse au stress, y compris un statut redox altéré via la voie PI3K/Akt24, une vérification améliorée des dommages à l'ADN via p5325,26 et NF-κB27,28 Régule la transcription, 29. Compte tenu de leur rôle critique dans la réponse au stress, la prolifération, l'apoptose et d'autres processus cellulaires clés, la PKR et la PACT sont des cibles thérapeutiques prometteuses pour de nombreuses maladies, en particulier le cancer30,31,32,33.Cependant, malgré cette signification fonctionnelle et biologique pléiotrope, la régulation de l'activité PACT/PKR dans les cellules cancéreuses reste insaisissable.
Les lncARN sont des transcrits de plus de 200 nucléotides sans potentiel de codage de protéines.Depuis que des projets de pointe de séquençage du génome entier ont identifié des milliers d'ARNlnc,35,36 de nombreux efforts ont été déployés pour élucider leurs fonctions biologiques.Un nombre croissant de recherches a montré que les lncRNA sont impliqués dans de nombreux processus biologiques37, notamment la régulation de l'inactivation du chromosome X38,39, l'empreinte40, la transcription41,42, la traduction43 et même la croissance du cancer44,45,46,47.Ces études ont rapporté que de nombreux ARNlnc sont impliqués dans la voie PACT/PKR.Une de ces études a montré que lncRNA ASPACT inhibait la transcription de PACT et augmentait la rétention nucléaire de l'ARNm de PACT.D'autres études ont montré que l'ARNnc nc886 se lie à PKR et inhibe sa phosphorylation49,50.Jusqu'à présent, aucun ARNlnc régulant l'activation de PKR médiée par PACT n'a été signalé.
L'ARN antisens 1 de l'aspartyl-ARNt synthétase (DARS-AS1) a été identifié comme un lncRNA oncogène51,52,53,54.Grâce à la régulation de miP-194-5p53, miP-12952 et miP-532-3p51, il a été démontré que DARS-AS1 favorise la croissance du carcinome rénal à cellules claires, du carcinome thyroïdien et du carcinome pulmonaire non à petites cellules, respectivement.Tong et ses collègues ont également découvert que DARS-AS1 favorise la progression du myélome en maintenant la stabilité du motif de liaison à l'ARN de la protéine 39 (RBM39).Cependant, aucune étude n'a été menée pour savoir si cet ARNnc est impliqué dans la régulation de l'activation de PACT-PKR et la réponse au stress des cellules cancéreuses.
Ici, nous avons effectué un dépistage à grande échelle de la perte de fonction à l'aide du système CRISPRi et déterminé que l'ARNlnc DARS-AS1 favorise la prolifération de plusieurs types de cellules cancéreuses.De plus, nous avons identifié un mécanisme majeur : DARS-AS1 se lie directement à PACT, inhibe la liaison de PACT et de PKR, empêche la phosphorylation de eIF2α, un substrat inférieur de PKR, et inhibe finalement la mort cellulaire apoptotique.En conclusion, nos travaux révèlent que l'lncRNA DARS-AS1 est un régulateur de la voie PACT-PKR et une cible potentielle pour le traitement et le pronostic du cancer.
Des études approfondies de profilage génomique ont identifié des centaines d'ARNlnc associés au cancer.Cependant, leur fonction reste largement méconnue56.Pour identifier les candidats lncRNA prometteurs impliqués dans la progression du cancer, nous avons effectué un criblage de perte de fonction pour une prolifération réduite dans la lignée cellulaire de cancer colorectal SW620 à l'aide du système CRISPRi (Fig. 1a).La caractéristique unique des lignées cellulaires de cancer du côlon SW480 et SW620 est qu'elles sont dérivées de tumeurs primaires et secondaires chez un seul patient.Cela fournit une comparaison précieuse pour étudier les changements génétiques dans la progression du cancer avancé du côlon.Par conséquent, nous avons analysé les transcriptomes des lignées cellulaires de cancer colorectal (SW480 et SW620) à l'aide du séquençage de l'ARN et avons collecté certains ARNlnc fonctionnels potentiels dans la littérature publiée.Sur la base de ces résultats, nous avons conçu une bibliothèque de sgRNA groupée contenant 7355 oligos de sgRNA ciblant 971 lncRNA associés au cancer et 500 oligos de sgRNA non ciblés pour un contrôle négatif (Données supplémentaires 1).
Représentation schématique du dépistage à l'aide du système CRISPRi.b Enrichissement en sgRNA après criblage.La ligne pointillée horizontale représente log2 (changement de pli) = ±0,58.La ligne pointillée verticale indique la valeur p = 0,05.Les points noirs représentent le sgRNA non ciblé (désigné par NC).Les points rouges sont des sgRNA ciblant DARS-AS1.Les points bleus sont des sgRNA ciblant LINC00205, un lncRNA oncogène décrit précédemment.changement de pli = (lecture normalisée, jour 17)/(lecture normalisée, jour 0).c L'inactivation de l'ARNsg DARS-AS1 a inhibé la croissance cellulaire.Les barres d'erreur représentent ± écart type des trois expériences.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 test t de Student bilatéral.d Expression de DARS-AS1 dans les tumeurs (ensemble de données TCGA).em Expression de DARS-AS1 dans des échantillons normaux et tumoraux appariés de patients atteints respectivement de BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP et COAD (ensemble de données TCGA).Les valeurs de p ont été obtenues à l'aide du test t de Student bilatéral apparié.
Après avoir construit le plasmide et empaqueté le lentivirus, nous avons transduit la lignée cellulaire de cancer colorectal dCas9-SW620 avec la bibliothèque ci-dessus dans quatre expériences d'infection indépendantes.La multiplicité d'infection (MOI) pour ces infections était de 0,1 à 0,3, ce qui indique que chaque cellule ne peut être transfectée qu'avec un seul ARNg.Après 18 jours de culture in vitro, le profil d'enrichissement des sgARN cibles a diminué ou augmenté après le criblage, tandis que le nombre d'oligonucléotides de contrôle non ciblés est resté relativement inchangé par rapport au profil de pré-criblage, indiquant que notre cible a un écran très spécifique bibliothèque.Riz.1b et tableau complémentaire 1). LINC00205, qui était précédemment signalé comme favorisant la progression du cancer du poumon et du cancer du foie58,59,60, a été éliminé (log2 (foldchange) <-0,58, valeur p <0,05), confirmant la fiabilité de ce dépistage (Fig. 1b). LINC00205, qui était précédemment signalé comme favorisant la progression du cancer du poumon et du cancer du foie58,59,60, a été éliminé (log2 (foldchange) <-0,58, valeur p <0,05), confirmant la fiabilité de ce dépistage (Fig. 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). LINC00205, précédemment signalé comme favorisant la progression du cancer du poumon et du cancer du foie58,59,60, a été exclu (log2 (fold change) <-0,58, p-value <0,05), confirmant la robustesse de ce dépistage (Fig. .1b) . Linc00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 掉 （log2 （倍数 变化） <-0,58 ， p 值 <0,05） ， 证实 了 该 筛选 的 可靠性 （图 1B）。 ， 证实 了 该 筛选 的 可靠性 （图 1B）。。 Linc00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 掉 （log2 （倍数 变化） <-0,58 ， p 值 <0,05） ， 证实 了 该 筛选 的 可靠性 （图 1B）。 ， 证实 了 该 筛选 的 可靠性 （图 1B）。。 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). LINC00205, précédemment signalé comme favorisant la progression du cancer du poumon et du foie58,59,60, a été exclu (log2 (multiplication) <-0,58, p-value <0,05), confirmant la robustesse de ce dépistage (Fig. .1b).
Parmi tous les lncRNA testés, DARS-AS1 a également été criblé, avec les trois oligonucléotides sgRNA apparentés significativement réduits après 18 jours de culture, ce qui suggère que l'inactivation de cet lncRNA a entraîné une réduction de la prolifération du cancer (Fig. 1b).Ce résultat a été étayé par une analyse MTS dans des cellules cancéreuses colorectales montrant que le taux de croissance des cellules knockdown DARS-AS1 n'était réduit que de moitié par rapport aux cellules témoins (Figure 1c) et était cohérent avec les rapports précédents de plusieurs autres types de cancer.: cancer du rein à cellules claires, cancer de la thyroïde et cancer du poumon non à petites cellules51,52,53,55.Cependant, sa fonction et ses mécanismes moléculaires dans le cancer colorectal restent inexplorés.Par conséquent, nous avons choisi cet ARNnc pour une étude plus approfondie.
Pour étudier l'expression de DARS-AS1 chez les patients, nous avons analysé de manière exhaustive 10 327 échantillons de tumeurs du projet Cancer Genome Atlas (TCGA).Nos résultats montrent que DARS-AS1 est largement exprimé et significativement régulé positivement dans les cellules saines de diverses tumeurs, notamment l'adénocarcinome du côlon (COAD), le carcinome à cellules claires du rein (KIRC) et le carcinome à cellules papillaires rénales (KIRP)..Très peu (Fig. 1d et Supplémentaire Fig. 1a, b). L'analyse d'échantillons sains/tumeurs appariés a en outre confirmé une expression significativement plus élevée de DARS-AS1 dans les tumeurs du carcinome urothélial de la vessie (BLCA), du carcinome à cellules claires du rein (KIRC), de l'adénocarcinome de la prostate (PRAD), du carcinome épidermoïde du poumon (LUSC) , carcinome de l'endomètre du corps utérin (UCEC), adénocarcinome du poumon (LUAD), carcinome hépatocellulaire du foie (LIHC), carcinome à cellules papillaires rénales du rein (KIRP) et adénocarcinome du côlon (COAD) (valeur de p <0, 05) (Fig. 1e – m) . L'analyse d'échantillons sains/tumeurs appariés a en outre confirmé une expression significativement plus élevée de DARS-AS1 dans les tumeurs du carcinome urothélial de la vessie (BLCA), du carcinome à cellules claires du rein (KIRC), de l'adénocarcinome de la prostate (PRAD), du carcinome épidermoïde du poumon (LUSC) , carcinome de l'endomètre du corps utérin (UCEC), adénocarcinome du poumon (LUAD), carcinome hépatocellulaire du foie (LIHC), carcinome à cellules papillaires rénales du rein (KIRP) et adénocarcinome du côlon (COAD) (valeur de p <0, 05) (Fig. 1e – m) .L'analyse d'échantillons sains/tumeurs appariés a également confirmé une expression significativement plus élevée de DARS-AS1 dans le carcinome urothélial de la vessie (BLCA), le carcinome rénal à cellules claires et le carcinome à cellules rénales (KIRC), l'adénocarcinome de la prostate (PRAD), le carcinome épidermoïde du poumon (LUSC) tumeurs., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m) . , carcinome de l'endomètre du corps de l'utérus (UCEC), adénocarcinome du poumon (LUAD), carcinome hépatocellulaire du foie (LIHC), carcinome à cellules papillaires du rein (KIRP) et adénocarcinome du côlon (COAD) (valeur de p < 0,05) (Fig. 1e–m) .配对 健康 / 肿瘤样本 的 分析 进一步 证实 了 DARS-AS1 在 膀胱 尿路 上 皮癌 (BLCA) 、 肾 肾 透明 细胞癌 (KIRC) 、 前列 腺腺癌 (PRAD) 、 肺鳞状 细胞癌 (LUSH) 肿瘤 中 的显着 更 高 表达 ， 子宫体子宫 内膜 癌 （UCEC） ， 肺腺癌 （LUAD） ， 肝肝 细胞癌 （LIHC） ， 肾 肾 乳头状 细胞癌 （KIRP） 和结肠腺癌 （COAD） （P 值<0.05）（图1e-m） .配 对 健康 / 肿瘤样本 的 分析 证实 了 DARS-OS1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 (PRAD) 、 细胞癌 细胞癌(Lush) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 显着 更 高 表达 ， 内膜 癌 （（Ucel） 肺腺癌 （（Luad） 肝肝 细胞癌 （LIHC） 肾 肾 乳头状 细胞 细胞癌 （kirp） （coad） （p 值<0.05）（图1e-m） .L'analyse d'échantillons appariés sains/tumeurs a confirmé le rôle de DARS-AS1 dans le carcinome urothélial de la vessie (BLCA), le carcinome à cellules claires du rein (KIRC), l'adénocarcinome de la prostate (PRAD) et le carcinome épidermoïde du poumon (LUSC).экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). expression dans le carcinome du corps utérin (UCEC), l'adénocarcinome pulmonaire (LUAD), le carcinome hépatocellulaire (LIHC), le carcinome papillaire rénal (KIRP) et l'adénocarcinome du côlon (COAD) (valeur p <0, 05) (Figure 1e -m).Pris ensemble, ces résultats indiquent que DARS-AS1 est largement et fortement exprimé dans une variété de cancers.
Étant donné que DARS-AS1 et DARS (le gène codant pour le brin antisens) partagent le même promoteur et sont situés l'un à côté de l'autre, nous avons conçu le shRNA pour renverser spécifiquement DARS-AS1 mais pas DARS (Fig. 2a, b et tableau supplémentaires 2) .En plus de SW620, nous avons également utilisé trois autres lignées cellulaires exprimant fortement DARS-AS1 pour étudier l'efficacité et la fonction de l'inactivation du shRNA (tableau supplémentaire 3).Nos résultats ont indiqué que les trois shARN développés atteignaient au moins 80% d'efficacité d'inactivation de DARS-AS1 avec peu d'effet sur la quantité d'ARNm de DARS (Fig. 2c – f supplémentaires).De plus, nous avons constaté que l'inactivation de DARS-AS1 avec ces shARN inhibait de manière significative la croissance cellulaire dans les lignées cellulaires de cancer colorectal SW620 (49,7 %) et HCT116 (27,7 %), la lignée cellulaire de cancer du sein MBA-MD-231 (53,4 %).) et la lignée cellulaire d'hépatome HepG2 (réduction de 92,7 %), ainsi que leur capacité à former des sphères non ancrées (réduction moyenne d'environ 50,8 %, 44,6 %, 40,7 % et 75,7 % par lignée cellulaire) (Fig. 2a, b).Dans SW620, les résultats du test de formation de colonies ont en outre confirmé que le shRNA DARS-AS1 inhibait de manière significative la prolifération cellulaire avec une diminution moyenne d'environ 69, 6% (Fig. 2c).
Effet du shRNA contrôle et du shRNA DARS-AS1 sur la prolifération cellulaire (a) et la formation de sphéroïdes (b) dans les cellules SW620, HCT116, MBA-MD-231 et HepG2.c Effet du shRNA contrôle et du shRNA DARS-AS1 sur la formation de colonies dans les cellules SW620.Prolifération cellulaire (d), formation de sphéroïdes (e) et formation de colonies (f) de cellules SW620 surexprimant DARS-AS1.Les données présentées sont la moyenne ± écart type de trois expériences.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 et *** p ≤ 0,001 par le test t de Student bilatéral.
Pour compléter les études de perte de fonction, nous avons ensuite créé des cellules SW620 surexprimant DARS-AS1 (Fig. 2g supplémentaire).La surexpression de DARS-AS1 a augmenté de manière significative la croissance cellulaire (1, 8 fois), la formation de sphéroïdes non ancrés (1, 4 fois) et la formation de colonies (3, 3 fois) dans les cellules SW620 (Fig. 2d – f).Nous avons confirmé ce résultat en utilisant une autre lignée cellulaire exprimant DARS-AS1, A549.Cette prolifération cellulaire accrue due à la surexpression de DARS-AS1 a en outre été observée dans les cellules A549 (Fig. 2h, i et tableau supplémentaire 3).Prises ensemble, ces études de gain et de perte démontrent que DARS-AS1 favorise la prolifération des cellules cancéreuses in vitro.
Pour explorer le mécanisme sous-jacent par lequel DARS-AS1 régule la prolifération cellulaire, nous avons effectué une analyse déroulante de l'ARN pour identifier ses partenaires potentiels de liaison aux protéines.Les résultats de la RT-qPCR ont montré qu'environ 86,2 % de DARS-AS1 se trouvent dans le cytoplasme des cellules SW620 (Fig. 3a supplémentaire).Le DARS-AS1 ou le pseudoARN biotinylé transcrit in vitro a ensuite été incubé avec des lysats de cellules SW620 suivi d'une séparation SDS-PAGE.Une coloration à l'argent ultérieure a montré qu'une bande distincte (~ 38 kDa) était significativement enrichie dans les échantillons d'extraction DARS-AS1, mais pas dans les échantillons d'ARN factices ou de billes (Fig. 3a).Cette bande a été identifiée comme une protéine activatrice de PKR (PACT) par spectrométrie de masse (MS) et confirmée par immunotransfert dans les lignées cellulaires SW620, HCT116 et HepG2 (Fig. 3a, b).L'enrichissement des DARS et des protéines PACT apparentées - PKR et TRBP - a également été étudié à l'aide de l'analyse de l'ARN par Western blot (WB).Les résultats ont indiqué qu'aucune interaction directe entre l'ARN de DARS-AS1 et ces trois protéines n'a été trouvée (Fig. 3b supplémentaire).L'interaction spécifique entre DARS-AS1 et PACT a été confirmée par une analyse d'immunoprécipitation d'ARN (RIP), qui a montré que DARS-AS1 était significativement enrichi en anticorps anti-PACT mais pas en d'autres ARN témoins (Figure 3c).Pour déterminer si DARS-AS1 interagit directement avec PACT en l'absence de tout autre composant cellulaire, un test d'interférométrie de biocouche in vitro (BLI) a été effectué à l'aide de PACT purifié.Le DARS-AS1 ou l'ARN factice marqué à la biotine a été immobilisé sur des biocapteurs à la streptavidine (SA), puis incubé dans un tampon cinétique contenant 1 μM de PACT.Notamment, PACT s'est fortement lié à DARS-AS1 (valeur KD ~ 26, 9 nM), mais pas pour imiter l'ARN (Figure 3d).Pris ensemble, ces résultats démontrent une interaction directe et une haute affinité entre DARS-AS1 et PACT.
L'analyse d'ARN pull a identifié DARS-AS1 interagissant avec PACT dans les cellules SW620.Ci-dessus, coloration à l'argent des protéines apparentées.Des immunoblots inférieurs ont été réalisés avec un anticorps anti-PACT.b Une analyse déroulante de l'ARN a été réalisée dans les cellules HCT116 (en haut) et HepG2 (en bas).L'enrichissement en PACT a été détecté par immunotransfert.Des tests d'immunoprécipitation d'ARNc (RIP) ont été effectués dans des cellules SW620 en utilisant les anticorps indiqués.d Les courbes de liaison de PACT à DARS-AS1 pleine longueur ou à l'ARN de contrôle ont été obtenues à l'aide de l'interférométrie de biocouche (BLI).L'ARN a été immobilisé sur un biocapteur de streptavidine.1 μM PACT a été utilisé pour mesurer l'association.Le test d'extraction d'ARN a été réalisé à l'aide de DARS-AS1 pleine longueur biotinylé ou tronqué (en haut).Immunoblot montrant PACT reçu (en bas).f Le PACT marqué purifié a été incubé avec DARS-AS1 pleine longueur biotinylé ou tronqué (comme dans e) pour le test RIP in vitro.L'ARN extrait a été vérifié par RT-qPCR.g L'affinité relative de différents fragments d'ARN pour PACT a été obtenue par interférométrie de biocouche.Pour l'analyse, 100 nM d'ARN et 1 μM de RAST ont été utilisés.h Des tests de RIP in vitro ont été effectués en utilisant du PACT marqué intact ou tronqué purifié.L'ARN extrait a été vérifié par RT-qPCR.i Taux de croissance des cellules SW620 surexprimant DARS-AS1, PACT ou les deux.j La surexpression de DARS-AS1 pleine longueur ou tronquée dans les cellules SW620 a eu des effets différents sur la croissance cellulaire.k L'apoptose a été détectée par immunotransfert avec un anticorps anti-PARP.l L'inactivation de DARS-AS1 induit l'apoptose des cellules SW620, comme le montre la cytométrie en flux.Les données présentées sont la moyenne ± écart type de trois expériences. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, par test t de Student bilatéral. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, par test t de Student bilatéral. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 par le test t de Student bilatéral. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 par le test t de Student bilatéral.
Nous avons ensuite généré trois fragments d'ARN DARS-AS1 biotinylés par transcription in vitro pour identifier la région DARS-AS1 requise pour l'association PACT (Figure 3e).Les résultats de l'analyse de l'ARN ont montré que chaque fragment était capable d'interagir avec PACT, mais la région 3'-terminale (384–768 nucléotides marqués A3) a montré plus de 1–384 nucléotides marqués A1) (Fig. 3e).Des résultats similaires ont été observés dans le test RIP in vitro utilisant du PACT recombinant (Figure 3f).Conformément à ces résultats, des expériences visant à lier des fragments d'ARN immobilisés à PACT à l'aide de BLI ont également montré que PACT a une affinité plus élevée pour A3 (384–768 nt) (valeur KD d'environ 94,6 nM), alors qu'il n'y a presque aucun lien avec d'autres zones.(Fig. 3d).
Nous avons également examiné les régions de liaison associées dans PACT.PACT contient trois domaines fonctionnels, dont deux sont des domaines de liaison à l'ARN double brin conservés (dsRBD) et un troisième domaine (désigné D3) qui agit comme un activateur des interactions protéiques.Pour examiner la capacité de liaison de l'ARNlnc de chaque domaine, nous avons conçu trois mutations qui ont supprimé chacun des trois domaines et effectué un test RIP in vitro.Nos résultats ont montré que la suppression du troisième domaine (D3) de PACT réduisait significativement son interaction avec DARS-AS1 (de 0,11 fois par rapport à PACT intact) par rapport aux deux autres mutations (Fig. 3h), il a été montré que la libération de D3 a interagi avec DARS.-AC1.Pris ensemble, ces résultats suggèrent que l'interaction entre DARS-AS1 et PACT peut se produire principalement par l'extrémité 3 'de DARS-AS1 et le domaine D3 de PACT.
Nous avons noté que DARS-AS1 n'avait aucun effet sur l'expression de PACT et que PACT n'avait aucun effet sur DARS-AS1 (Fig. 3c supplémentaire).Nous avons ensuite examiné l'effet du knockdown PACT sur la croissance cellulaire.Contrairement à DARS-AS1, les cellules relatives se sont développées 1, 5 à 3 fois plus rapidement lorsque PACT a été renversé (Fig. 3d supplémentaire).Les résultats du test de formation de colonies ont indiqué que les cellules formaient des colonies 2 à 3 fois après le traitement par shRNA avec PACT (Fig. 3e supplémentaire).Pour tester si DARS-AS1 régule la prolifération cellulaire via PACT, nous avons généré des cellules SW620 surexprimant PACT, DARS-AS1 ou les deux.La surexpression de PACT a montré une inhibition significative de la prolifération cellulaire (Figure 3i).Alors que la surexpression de DARS-AS1 en soi favorisait de manière significative la prolifération cellulaire, il n'y avait pas de différence significative dans le taux de croissance des cellules surexprimant DARS-AS1 et PACT.Ces résultats suggèrent que PACT pourrait contrecarrer la prolifération accrue causée par la surexpression de DARS-AS1.
Étant donné que différentes régions de DARS-AS1 ont différentes capacités de liaison à PACT, nous avons étudié leur influence relative sur la prolifération cellulaire par différentes surexpressions de fragments de DARS-AS1.Comparé aux deux autres fragments, DARS-AS1 était surexprimé à l'extrémité 3 '(384–768 nt), la principale région liée à PACT dans DARS-AS1, qui avait la plus grande capacité à stimuler la prolifération cellulaire (Fig. 3j).Ces résultats indiquent une corrélation positive entre la capacité de liaison et la fonction biologique de DARS-AS1.
PACT a été signalé comme étant une protéine pro-apoptotique19.Par conséquent, nous avons étudié l'effet de DARS-AS1 sur l'apoptose.Comme prévu, l'inactivation de DARS-AS1 a considérablement augmenté le clivage PARP dans les cellules SW620 et augmenté la proportion de cellules positives à l'annexine V dans les lignées cellulaires SW620, HCT116, HepG2 et MBA-MD-231 (Fig. 3k).3).3f – h), indiquant que l'effet anti-apoptotique de DARS-AS1 dans les cellules cancéreuses est opposé à la fonction induisant l'apoptose de PACT.Pris ensemble, ces résultats suggèrent que le mécanisme de la fonction oncogène de DARS-AS1 pourrait passer par l'inhibition de la fonction PACT.
Ensuite, nous avons exploré les implications fonctionnelles de l'association DARS-AS1-PACT.Il a été rapporté que PACT active PKR par interaction directe, ce qui améliore ensuite la phosphorylation de eIF2α, provoquant une suppression traductionnelle et une apoptose17.Tout d'abord, nous avons examiné si DARS-AS1 affecte la localisation cellulaire de PACT et PKR.La microscopie confocale à fluorescence a montré que PACT et PKR étaient fortement colocalisés dans les cellules SW620 avec un coefficient de corrélation de Pearson moyen de 0,72.Pendant ce temps, la surexpression de DARS-AS1 a considérablement réduit la co-localisation de PACT et de PKR (coefficient de corrélation de Pearson moyen de 0, 61) (Figure 4a).Pour déterminer si DARS-AS1 pouvait moduler l'interaction PACT-PKR, nous avons effectué un test de co-immunoprécipitation (co-IP) avec un anticorps anti-PACT dans des lysats de cellules SW620.La PKR était fortement enrichie en anti-PACT dans les cellules témoins, tandis que la récupération de PKR était significativement réduite dans les lysats de cellules surexprimant DARS-AS1 (Fig. 4b).PACT et PKR marqués purifiés ont été utilisés pour des essais de liaison aux protéines in vitro.En conséquence, ceux qui ont fourni DARS-AS1 mais pas d'ARN de contrôle ont montré une interaction PACT-PKR supprimée (Figure 4c).Tous les résultats ont montré que DARS-AS1 perturbait la communication PACT et PKR.
a La co-localisation de PACT et de PKR dans des cellules témoins ou des cellules surexprimant DARS-AS1 a été observée en utilisant la microscopie confocale à fluorescence.Les noyaux ont été colorés au DAPI.Les résultats statistiques ont été obtenus à partir de 16 photographies.b Co-immunoprécipitation (co-IP) utilisant un anticorps anti-PACT dans des lysats cellulaires de cellules SW620 témoins ou de cellules surexprimant DARS-AS1.c PACT marqué, PKR purifié et transcrit in vitro avec DARS-AS1 ou ARN factice ont été incubés pour une analyse de liaison aux protéines in vitro.Des anticorps anti-flag ont été utilisés pour l'immunoprécipitation.d Des immunoblots avec les anticorps indiqués ont été réalisés dans des cellules SW620 et HCT116 transfectées avec un shRNA contrôle ou DARS-AS1-shRNA suivi d'une privation de sérum.e Les niveaux d'expression de DARS-AS1 ont modifié la sensibilité cellulaire à la thapsigargine.Les cellules SW620 ont été transfectées avec le shRNA DARS-AS1, le plasmide de surexpression DARS-AS1 ou le plasmide de contrôle.Les cellules ont été traitées avec de la thapsigargine pendant 48 heures et la viabilité cellulaire a été déterminée à l'aide du réactif MTS.f Le DARS-AS1 transcrit in vitro ou l'ARN factice et le PACT purifié ont été utilisés pour le test d'activation in vitro et la détection par immunotransfert.g Des immunoblots utilisant ces anticorps ont été réalisés sur des cellules SW620-ctrl (à gauche) ou des cellules surexprimant des mutants PKR (à droite).Ces cellules ont ensuite été transfectées avec un shRNA contrôle ou DARS-AS1-shRNA suivi d'une privation de sérum.h La cytométrie en flux a montré que l'inactivation de la PKR mutante compensait l'apoptose induite par DARS-AS1 dans les cellules SW620.i Des immunoblots avec les anticorps indiqués ont été réalisés dans des cellules SW620 (à gauche) ou HCT116 (à droite).Les cellules transfectées avec le shRNA contrôle ou le shRNA DARS-AS1 sont privées de sérum et complétées avec 100 nM d'inhibiteur de PKR C16 ou de DMSO.Barre d'échelle = 5 µm.Les données présentées sont la moyenne ± écart type de trois expériences.* p ≤ 0,05 test t de Student bilatéral.
On pense généralement qu'une fois que PACT interagit avec PKR17, la phosphorylation de PKR au niveau de Thr451 peut être induite.Nos résultats ont indiqué que le niveau de phosphorylation de PKR était significativement élevé dans les cellules knockdown DARS-AS1 après une privation de sérum (Fig. 4d et Fig. 4a supplémentaire).En conséquence, nous avons constaté que la phosphorylation de eIF2α, le principal substrat de la PKR, était également significativement augmentée par le shRNA DARS-AS1 (Fig. 4d et Fig. 4a supplémentaire).La thapsigargine est un facteur de stress du RE qui provoque la libération de Ca2+ par le RE.Il a été rapporté que le traitement à la thapsigargine induisait l'expression et l'activation de PACT, qui interagit davantage avec et active PKR, conduisant à l'apoptose en augmentant la phosphorylation de eIF2α 18,61 .Ici, nous avons utilisé la thapsigargine comme stimulateur de la voie PACT/PKR pour déterminer si DARS-AS1 peut aider les cellules à surmonter le stress en inhibant la voie PACT/PKR.Nous avons observé que le niveau d'expression de DARS-AS1 était positivement corrélé à la résistance cellulaire à la thapsigargine.Les cellules SW620 surexprimant DARS-AS1 ont mieux survécu lorsqu'elles ont été traitées avec de la thapsigargine, tandis que les cellules avec l'inactivation de DARS-AS1 sont devenues plus sensibles (Fig. 4e).Conformément à ces résultats, la surexpression de DARS-AS1 a réduit la phosphorylation de PKR induite par la thapsigargine (Fig. 4b supplémentaire).En revanche, après le traitement à la thapsigargine, PKR et eIF2α ont été phosphorylés à un degré plus élevé dans les cellules knockdown DARS-AS1 par rapport aux cellules témoins (Fig. 4b supplémentaire).Fait intéressant, la thapsigargine a induit l'expression de DARS-AS1 de manière dose-dépendante, ce qui peut indiquer une fonction anti-stress de DARS-AS1 (Fig. 4c supplémentaire).De plus, nous avons effectué des tests d'activation in vitro pour confirmer ces observations.Brièvement, la PKR a été purifiée à partir de lysats cellulaires à l'aide d'un anticorps anti-PKR, puis incubée avec du PACT recombinant et du DARS-AS1 transcrit in vitro.Après la réaction enzymatique, la phospho-PKR a été détectée à l'aide de WB.Nos résultats ont indiqué que la phosphorylation de PKR était significativement inhibée par DARS-AS1, mais pas par l'ARN témoin (Figure 4f).Ces résultats in vitro et in vivo suggèrent que DARS-AS1 inhibe l'activation de PKR médiée par PACT.Dans le même temps, nous avons également observé une diminution de la récupération de PACT en présence de DARS-AS1 (Figure 4f).Ce résultat est cohérent avec les résultats du test de liaison aux protéines in vitro (figure 4c) et illustre à nouveau la fonction de blocage de DARS-AS1 pour l'association PACT-PKR.
Ser246 et Ser287 dans le domaine D3 de PACT sont nécessaires à l'activation de PKR sous stress cellulaire.La substitution de deux résidus sérine à l'alanine a donné le mutant PACT (mutD), qui a activé la PKR en l'absence de stress, et la substitution à l'alanine (mutA) a inversé le protocole.Puisque nous avons démontré l'importance de ce domaine en association directe avec DARS-AS1, nous avons généré ces deux mutants PACT pour tester si ces résidus pouvaient également être impliqués dans l'interaction avec DARS-AS1.Fait intéressant, les deux mutants ont perdu la capacité de se lier à DARS-AS1 (Fig. 4d supplémentaire), ce qui suggère que la structure complète de la protéine PACT peut être nécessaire pour une interaction efficace avec DARS-AS1.
De plus, nos résultats suggèrent également que l'inhibition de la prolifération cellulaire induite par DARS-AS1-shRNA peut être partiellement restaurée en surexprimant un mutant PACT négatif dominant (PACTmutA) ou un mutant PKR négatif dominant (PKRmut) (Fig. 4e. e supplémentaire).La surexpression de mutants PKR dominants négatifs a réduit la phosphorylation de PKR induite par l'inactivation de DARS-AS1 ainsi que la phosphorylation de eIF2α dans des cellules privées de sérum (Fig. 4g).Plus important encore, la proportion de cellules apoptotiques induites par l'inactivation de DARS-AS1 a également été réduite dans les cellules surexprimant PKRmut (Fig. 4h et Supplémentaire Fig. 4g).L'inhibition de l'activité de la PKR kinase altère également la fonction de DARS-AS1, car les résultats ont montré que l'inactivation de DARS-AS1 déclenchait rarement la phosphorylation de PKR et de eIF2α lorsque les cellules étaient traitées avec un inhibiteur C16 spécifique de PKR (Fig. 4i et Supplémentaire Fig. 4h).).Pris ensemble, nos résultats suggèrent que DARS-AS1 favorise la prolifération cellulaire, au moins en partie, en inhibant l'activation de PKR médiée par PACT.
Pour explorer davantage le rôle de DARS-AS1 dans la tumorigenèse, nous avons réalisé des expériences in vivo en utilisant un modèle de xénogreffe de souris. Les résultats montrent que l'inactivation de DARS-AS1 a considérablement réduit la croissance tumorale chez la souris (valeur p <0, 0001) (Fig. 5a). Les résultats montrent que l'inactivation de DARS-AS1 a considérablement réduit la croissance tumorale chez la souris (valeur p <0, 0001) (Fig. 5a). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значерс1) (p <0,050с1). Les résultats montrent que l'inactivation de DARS-AS1 réduit considérablement la croissance tumorale chez la souris (valeur p <0, 0001) (Figure 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（图5a）。结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a）。 Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (50 0,0). Les résultats ont montré que l'inactivation de DARS-AS1 réduisait de manière significative la croissance tumorale chez la souris (valeur p <0, 0001) (Figure 5a).Ainsi, dans le groupe knockdown DARS-AS1, il y a eu une diminution significative du volume moyen de la tumeur d'environ 72,9 % et de la masse tumorale moyenne d'environ 87,8 % (Figure 5b-d).Ces résultats suggèrent fortement que DARS-AS1 peut favoriser de manière significative la croissance tumorale in vivo.
Effets de l'inactivation de l'annonce DARS-AS1 sur l'oncogenèse colorectale chez la souris nude.Les courbes de croissance (a), la taille de la tumeur (b), le poids (c) et les images de la tumeur (d) sont présentées.Les barres d'erreur représentent ± SEM. n = 10. ****p < 0,0001, par le test t de Student bilatéral. n = 10. ****p < 0,0001, par le test t de Student bilatéral. n = 10. ****p < 0,0001 pour двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0,0001 test t de Student bilatéral.n = 10. ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0.0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0,0001 test t de Student bilatéral.e Kaplan-Meier a analysé la corrélation entre les niveaux d'expression de DARS-AS1 et la survie globale chez les patients atteints d'UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM et LGG.Les niveaux élevés d'expression de DARS-AS1 chez les patients se situaient dans les 50 % supérieurs ;le faible niveau d'expression de DARS-AS1 chez les patients se situait dans les 50 % inférieurs.Les valeurs de p ont été déterminées à l'aide du test du log rank.f Modèle proposé dans lequel DARS-AS1 régule la voie PACT-PKR et la croissance tumorale.
Pour mieux comprendre l'impact clinique de DARS-AS1, nous avons examiné la corrélation entre son expression et la survie des patients.En analysant l'ensemble de données TCGA, nous avons constaté qu'une expression plus élevée de DARS-AS1 était associée au mélanome uvéal (UVM), à la chromophobie rénale (KICH), au carcinome à cellules papillaires rénales (KIRP), au mésothéliome (MESO), au multiplex.Une survie plus faible était significativement associée à la morphose du glioblastome (GBM) et aux patients atteints de gliome cérébral de bas grade (LGG) (Figure 5e).Ces résultats suggèrent que DARS-AS1 pourrait jouer un rôle important dans la progression clinique de la tumeur et pourrait être un biomarqueur prédictif potentiel dans de multiples cancers.
Dans cette étude, à l'aide d'un criblage fonctionnel CRISPRi à grande échelle, nous avons déterminé que l'ARNlnc DARS-AS1 surmonte le stress des cellules cancéreuses en régulant deux principaux répondeurs au stress, PACT et PKR.En interagissant directement avec PACT, DARS-AS1 a inhibé l'activation de PKR médiée par PACT, empêchant ainsi la mort cellulaire apoptotique et favorisant la prolifération cellulaire (Fig. 5f).Une régulation à la hausse de DARS-AS1 a été observée dans plusieurs types de cancer, ce qui suggère que sa fonction de promotion de la survie des cellules cancéreuses dans des conditions stressantes peut être largement applicable à plusieurs types de cancer.
PACT a été identifiée comme une protéine activatrice de PKR, et l'activation de PKR médiée par PACT joue un rôle important dans les réponses au stress en régulant la transcription, la traduction, l'apoptose et d'autres processus cellulaires importants62.Pendant des décennies, des tentatives ont été faites pour comprendre la régulation spécifique au cancer de la cascade PACT-PKR.Ici, notre étude a révélé un mécanisme différent de régulation de PACT-PKR dans les cellules cancéreuses par l'ARNlnc cellulaire DARS-AS1, qui se lie directement à PACT, bloque l'interaction PACT-PKR, inhibe l'activation de PKR et la phosphorylation de eIF2α, inhibant ainsi l'apoptose induite par le stress et stimulant la prolifération éventuelle du cancer.cellules.Cette découverte met en lumière les cibles potentielles d'ARNlnc pour le pronostic et le traitement du cancer.
Nos données ont montré que l'inactivation de DARS-AS1 sensibilise les cellules à la privation de sérum avec une augmentation significative de la PKR phosphorylée et de l'eIF2α.Ces résultats suggèrent que DARS-AS1 favorise la survie des cellules cancéreuses dans des conditions difficiles en inhibant l'activité PACT/PKR.Plusieurs autres ARN non codants, tels que ASPACT et nc886, sont également impliqués dans l'axe PACT/PKR en régulant à la baisse l'ARNm de PACT48 ou en régulant l'autophosphorylation en se liant à PKR49,50,64.Parmi eux, DARS-AS1 agit comme un perturbateur de l'association PACT-PKR.Cette étude enrichit notre compréhension de la régulation de l'axe PACT/PKR et du rôle des lncRNAs dans les réponses au stress.
PACT contient trois domaines distincts.Chacun des deux premiers dsRBD est suffisant pour obtenir une liaison de haute affinité de PACT à PKR, tandis que le troisième domaine (D3) est requis pour l'activation de PKR in vitro et in vivo.Notre étude a montré que DARS-AS1 interagit préférentiellement avec le domaine D3 (Fig. 3h).Compte tenu de la grande taille de l'ARNnc (768 nucléotides), la liaison de DARS-AS1 à D3 peut inhiber physiquement l'interaction entre le domaine PACT de dsRBD et PKR, bloquant ainsi l'association de PACT et PKR.Les mutations ponctuelles PACT qui ont remplacé Ser246 et Ser287 dans D3 par de l'alanine ou de l'aspartate ont perturbé son affinité de liaison pour DARS-AS1, soulignant l'importance des propriétés structurelles et électriques globales de D3 dans leur association.De plus amples détails sur ce mécanisme seront nécessaires à l'avenir, en utilisant une analyse biochimique plus précise et une analyse structurelle PACT à haute résolution.
Des études antérieures ont rapporté que DARS-AS1 favorise la prolifération cellulaire par plusieurs mécanismes51,52,53.Dans un exemple, les chercheurs ont observé que DARS-AS1 régulait à la hausse son gène DARS codant pour la protéine antisens en ciblant miP-194-5p dans les cellules cancéreuses du rein.Cependant, dans la présente étude, l'inactivation de DARS-AS1 a eu peu d'effet sur la transcription de DARS dans plusieurs types de cancer, y compris au moins les cancers colorectaux, du sein et du foie.Étant donné que les lncRNA présentent des modèles d'expression spécifiques aux cellules et aux tissus, les mécanismes fonctionnels peuvent ne pas être conservés d'un type de cancer à l'autre, ce qui peut contribuer à cet écart entre nos observations et les évaluations précédentes de différents cancers.Des études spéciales sont nécessaires pour élucider les mécanismes spécifiques de divers processus physiologiques et pathologiques.
Une analyse des données cliniques a montré que l'expression de DARS-AS1 dans les tumeurs est inversement corrélée à la survie des patients cancéreux, ce qui souligne l'importance de l'axe DARS-AS1/PACT/PKR dans le pronostic du cancer.En conclusion, notre étude montre que DARS-AS1 est un régulateur de l'axe de signalisation PACT/PKR, favorise la prolifération des cellules cancéreuses et inhibe l'apoptose lors de la réponse au stress, ce qui fournit une autre piste de recherche et présente un intérêt pour les recherches futures sur des traitements potentiels. .
Les lignées cellulaires humaines SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 et HEK293T ont été obtenues auprès de la National Cell Line Resource Infrastructure en Chine.Toutes les cellules ont été maintenues dans du milieu DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) additionné de 10 % de FBS (Gemini, Brooklyn, NY) et de 1 % de pénicilline-streptomycine (Thermo Fisher Scientific) à 37 °C, 5 % de CO2.incubateur.
Anti-PACTE, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (phospho-T451), Abcam (ab81303);Anti-Drapeau, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));anti-eIF2α (phosphore S51), Abcam (ab32157) ;anti-PACT (phosphore S246), Abgent (AP7744b);anti-β-tubuline, CST (2128);IgG de souris normale, CST (5415S);IgG de lapin normal, CST (2729S).Les anticorps ont été dilués au 1:1000 dans du PBST pour le Western blot et au 1:100 pour l'IP.
Les sgARN ont été développés à l'aide d'un outil accessible au public appelé CRISPR-ERA66.Nous avons utilisé les paramètres d'outil par défaut pour le développement de sgRNA et l'algorithme a calculé les sites de liaison de sgRNA dans la région de 3 kb.centré sur TSS.Des pools d'oligonucléotides sgRNA ont été synthétisés chez CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) et clonés dans des plasmides pgRNA humanisés (Addgene # 44248).Un total de 12 µg de plasmide pgRNA humanisé regroupé, 7,2 µg de psPAX2 (Addgene #12260) et 4,8 µg de pMD2.G (Addgene #12259) ont été co-transfectés dans 5 x 106 HEK293T dans des boîtes de 10 cm à l'aide du réactif de transfection DNAfect cellules (CWBIO, Pékin, Chine) en suivant les instructions du fabricant.Les surnageants contenant le virus ont été recueillis 48 et 72 heures après la transfection et filtrés à travers un filtre de 0,45 pm.Pour le criblage, des cellules SW620 exprimant la protéine de fusion dCas9/KRAB ont été obtenues par transduction virale.Des cellules SW620 modifiées ont été infectées avec la banque de virus dans quatre expériences d'infection indépendantes à un MOI de 0, 1 à 0, 3 et ont été échantillonnées avec 2 μg / ml de puromycine (Sigma, St. Louis, MO) pendant 2 jours.Par la suite, les cellules ont été cultivées pendant 18 jours in vitro avec une couverture de bibliothèque minimale de 500 cellules/sgRNA pour le criblage.
L'ADN génomique a été extrait selon les instructions du kit QIAamp DNA Blood Midi (QIAGEN, Düsseldorf, Allemagne ; 51183).Au total, 100 μg d'ADN génomique par répétition biologique ont été utilisés pour construire la banque.La région sgRNA a été amplifiée par deux cycles de PCR et liée à un code-barres.
Les produits de PCR ont été purifiés à l'aide du gel NucleoSpin® et du kit de purification PCR (MACHEREY-NAGEL, Düren, Allemagne ; 740609.250) et quantifiés à l'aide du kit de détection d'ADN double brin Qubit™ HS (Thermo Fisher Scientific ; Q32854).
Le test MTS a été utilisé pour mesurer la prolifération cellulaire.Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits à une densité initiale de 2000 cellules/puits.Le nombre relatif de cellules a été mesuré quotidiennement à l'heure indiquée pendant un total de 4 à 6 jours.Pour chaque puits, 20 µl de réactif MTS (Promega) ont été dilués avec 100 µl de DMEM, incubés avec des cellules pendant 4 h à 37°C, puis la DO490 a été mesurée.
La capacité de croissance non ancrée a été découverte en analysant la formation de sphères.En bref, 2000 cellules transfectées avec le shRNA DARS-AS1 ou le shRNA contrôle ont été cultivées dans des microplaques à ultra faible attachement (Corning) avec un changement de milieu tous les 4 jours.Les sphéroïdes ont été comptés après 14 jours.500 cellules transfectées avec le plasmide de surexpression DARS-AS1 ou un plasmide contrôle ont été utilisées pour le test d'amplification, sinon la méthode était inchangée.
L'ARN a été transcrit en utilisant l'ARN polymérase T7 et la biotine-16-UTP (Roche 1138908910) selon les instructions de Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).Les amorces utilisées ici sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 4.
Les régions PACT ou PKR codant pour les protéines ont été clonées dans pET15b (Addgene #73619) et transformées dans BL21(DE3).Les bactéries ont été incubées pendant une nuit dans du LB alimenté en ampicilline puis diluées 100 fois avec du LB frais.Lorsque la DO6oo du milieu a atteint 0,8, de l'IPTG 1 mM a été ajouté pour induire l'expression de la protéine.Après incubation pendant une nuit sous agitation douce (250 rpm à 20°C), le culot cellulaire a été recueilli par centrifugation (4000 rpm, 10 min, 4°C).Remettre en suspension le culot cellulaire dans un tampon de lyse (Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 250 mM, PMSF 1 mM) et incuber sur de la glace pendant 30 min, puis sonication (15 min, 5 s on/off, sur la glace) et centrifuger (13 000 tr/min)., 30 min, 4°С).Le surnageant a ensuite été chargé sur de la résine Ni-NTA (QIAGEN) 3 fois à 4°C, lavé 4 fois avec un tampon de lavage (Tris 50 mM, pH 8,0, imidazole 40 mM, NaCl 250 mM) et élué 3 fois, avec un total de 10 ml de tampon éluant (Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 250 mM, imidazole 300 mM).La protéine purifiée a été déterminée à l'aide de WB et la concentration a été déterminée à l'aide du kit d'analyse de protéines Qubit™ (Thermo Fisher Scientific ; Q 33212).
Les tests RIP ont été effectués comme décrit précédemment, avec des modifications.En bref, 1x tampon RIP (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5% NP-40, RNasin ribonucléase inhibiteur (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, protéase) lyse cytostatique 1 x 107 cocktail (Roche, 1 mM DTT) et centrifuger à 13 000 tr/min pendant 15 min à 4 °C.Le surnageant a ensuite été incubé avec des billes magnétiques de protéine A+G (Millipore) conjuguées à 5 µg d'anticorps anti-PACT (Abeam) ou IgG (CST).Les billes ont été lavées 5 fois avec du tampon RIP 5x, puis digérées avec de la protéinase K (NEB).L'ARN a été extrait avec Trizol et déterminé par RT-qPCR.Les amorces sont présentées dans le tableau supplémentaire 5.
Le test RIP in vitro a été réalisé selon un protocole de test RIP standard modifié.Un total de 5 pmol d'ARN transcrit in vitro a été dilué 1x avec du tampon RIP et recuit par incubation à 65°C pendant 5 minutes suivi d'un refroidissement lent à température ambiante.Un total de 5 pmol de protéines PACT marquées par un drapeau intactes ou mutées ont été purifiées à partir d'E. coli.Incuber avec l'ARN renaturé pendant 2 heures à 4°C et suivre la procédure ci-dessus pour l'analyse RIP pour l'IP anti-drapeau.
Pour l'analyse d'extension d'ARN, 1 x 107 cellules ont été lysées avec du tampon 1 x RIP.Après centrifugation à 13 000 tr/min pendant 15 min à 4°C, le surnageant a été prétraité avec 30 µl de billes magnétiques de streptavidine (Beckman) pendant 2 h à 4°C.Le lysat purifié a ensuite été alimenté avec de l'ARNt de levure et incubé avec 40 pmol d'ARN renaturé pendant une nuit à 4 ° C, puis pendant encore 2 heures et 20 μl de nouvelles billes magnétiques de streptavidine bloquées avec du BSA ont été ajoutés.L'étape de lavage consistait en 4 fois avec un tampon RIP 5x et 4 fois avec un tampon RIP 1x.Les protéines correspondantes ont été éluées avec un tampon d'élution biotine (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 12,5 mM D-biotine, PMSF) et séparées sur NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).Après coloration à l'argent (Beyotime Biotechnology), certaines bandes ont été excisées et analysées par MS.
Une analyse Co-IP a été réalisée pour tester l'interaction entre PACT et PKR.En bref, les lysats surnageants ont été préparés en incubant 1 x 107 cellules lysées dans du tampon 1 x RIP suivi d'une centrifugation à 13 000 tr/min pendant 15 minutes à 4°C.Les lysats ont été chargés avec des billes magnétiques de protéine A + G, conjugués avec 5 µg d'anticorps anti-PACT et doucement mis en rotation pendant une nuit à 4 °C.Les billes ont été lavées 3 fois avec du tampon 5x RIP, deux fois avec du tampon 1x RIP et éluées avec du tampon 1x SDS.La protéine récupérée a été analysée par gel SDS-PAGE et détectée par WB.
Deux pmol de PACT marqué et 1 pmol de PKR ont été purifiés à partir d'E. coli.Diluer dans du tampon RIP 1 × et incuber avec 10 pmol d'ARN renaturé pendant 2 heures à 4 ° C.Après cela, ils ont été incubés avec un anticorps anti-marqué conjugué à des billes magnétiques de protéine A + G pendant deux heures supplémentaires.Les billes ont ensuite été lavées quatre fois avec du tampon RIP 1x et éluées avec du tampon SDS 1x.Les PACT et PKR résultants ont été détectés par WB.